Humoral immune response in Eurasian otters (Lutra lutra), Asian small-clawed otters (Aonyx cinereus) and North American river otters (Lontra canadensis) after vaccination with different canine distemper virus vaccines | Humorale Immunantwort bei Europäischen Fischottern (Lutra lutra), Asiatischen Kurzkrallenottern (Aonyx cinereus) und Nordamerikanischen Fischottern (Lontra canadensis) nach Impfung mit unterschiedlichen Staupe Impfstoffen

1\. INTRODUCTION 1 2\. REVIEW OF LITERATURE 3 2.1 Canine distemper 3 2.1.1 Taxonomy 3 2.1.2 Morphology 3 2.1.3 Proteins 5 2.1.4 Physical properties 6 2.1.5 Genotypes 6 2.1.5.1 CDV vaccine strains 6 2.1.6 Pathogenesis and clinical signs 8 2.1.7 Epidemiology 9 2.1.8 Canine distemper in non-domestic species 11 2.1.9 Immune response 16 2.1.10 CDV diagnosis 18 2.1.10.1 Virus detection 18 2.1.10.2 Antibody detection 19 2.1.11 Prevention and control 21 2.2 Canine distemper vaccination 22 2.2.1 Principles of vaccination 22 2.2.2 Canine distemper vaccines 22 2.2.2.1 Modified live virus vaccines 22 2.2.2.2 Inactivated vaccine 24 2.2.2.3 CDV-ISCOM subunit vaccine 25 2.2.2.4 Recombinant vaccines 25 2.2.2.5 DNA vaccines 26 2.2.3 Vaccination schedules 26 2.2.4 Failures in vaccination 27 3\. AIMS OF THE STUDY 29 4\. MATERIALS AND METHODS 30 4.1 Study animals 31 4.2 Vaccines and vaccination intervals 32 4.3 Immobilisation and blood-sampling 33 4.4 Laboratory diagnosis 34 4.4.1 Processing of blood 34 4.4.2 Cell cultures 35 4.4.3 Viruses 35 4.4.4 Neutralising peroxidase-linked antibody test (NPLAT) 35 4.4.5 Indirect enzyme- linked immonosorbent assay (ELISA) 37 4.4.6 Expressing and presenting serologic results 39 4.5 Statistical analysis 40 5\. RESULTS 41 Study 1: Otters previously not vaccinated 5.1 Inactivated CDV vaccine 41 5.1.1 Sample distribution 41 5.1.2 Prevalence of CDV-specific antibodies 42 5.1.3 Sero- response after vaccination with inactivated CDV vaccine 42 5.1.3.1 Eurasian otter 42 5.1.3.2 North American river otter 44 5.1.3.3 Asian small-clawed otter 44 5.1.4 Comparison of sero-response to inactivated CDV vaccine in the three otter species 47 5.2 CDV-ISCOM vaccine 47 5.2.1 Sample distribution 47 5.2.2 Prevalence of CDV-specific antibodies 48 5.2.3 Sero-response after vaccination with CDV-ISCOM vaccine 48 5.2.3.1 Eurasian otters 48 5.2.3.2 Asian small-clawed otters 49 5.2.3.3 Comparison of immune response to CDV-ISCOM vaccine in the two otter species 50 5.3 Modified live virus CDV vaccines 53 5.3.1 Sample distribution 53 5.3.2 Prevalence of CDV-specific antibodies 54 5.3.3 Sero-response after vaccination with modified live virus vaccine 54 5.3.3.1 Eurasian otters 54 5.3.3.2 Asian small-clawed otters 55 5.3.4 Comparison of sero-response to modified live virus vaccines between the two otter species 56 5.3.5 Influence of vaccine strain on sero-response 58 5.3.5.1 Chicken-cell culture adapted vaccine strain in Eurasian otters and Asian small-clawed otters 58 5.3.5.2 Different vaccine strains in Eurasian otters 59 5.4 Comparison of the three vaccine types in Eurasian otters and Asian small- clawed otters 61 5.5. Comparison of ELISA and virus neutralisation test 62 Study 2: Booster vaccination 5.6 Booster vaccination with modified live virus vaccine in Eurasian otters 63 5.6.1 Sample distribution 63 5.6.2 Prevalence of CDV-specific antibodies 63 5.6.3 Sero-response after booster vaccination with modified live virus vaccine 64 6\. DISCUSSION 66 6.1 CDV vaccination in otters 66 6.2 Statistics 67 6.3 Laboratory diagnosis 68 6.3.1 Neutralising peroxidase-linked antibody test 69 6.3.2 Indirect ELISA 69 6.4 Sero-response to vaccination 70 6.4.1 Inactivated CDV vaccine 70 6.4.2 CDV-ISCOM vaccine 71 6.4.3 Modified live virus vaccine 73 6.5 Comparison of ELISA and virus neutralisation test 74 6.6 Factors influencing sero-response 75 6.7 Booster vaccination 77 6.8 Comparison of vaccine efficacy in the two otter species 77 7\. CONCLUSION 79 8\. SUMMARY 81 9\. ZUSAMMENFASSUNG 83 10\. REFERENCES 85 11\. APPENDIX 108 Appendix I 108 Appendix II 109 Appendix III 112 List of Tables 115 List of Figures 117 Publications 118 Acknowledgements 119 Selbständigkeitserklärung 122

Canine distemper, a highly contagious systemic disease in dogs and other carnivores is considered to be the most serious infectious disease in mustelids. In this thesis, the efficacy and safety of canine distemper virus (CDV) vaccines available in Europe were evaluated in Eurasian otters (Lutra lutra), Asian-small-clawed otters (Aonyx cinereus), and to some extent in North American river otters (Lontra canadensis). Two methods of antibody determination were compared. The virus neutralisation test (VNT) is considered to be the gold standard for determining immunity to morbilliviruses (Appel 1973; von Messling et al. 1999), but takes time and is expensive. An easy and rapid to perform ELISA would be very helpful. Seventy otters originating from 19 different zoos in Germany and the Netherlands of both sexes and ranging in age between 8 weeks and 17 years were vaccinated. Two studies were conducted. In study 1, previously unvaccinated Eurasian otters (n=27), Asian small-clawed otters (n=28) and North American river otters (n=4) were vaccinated either with inactivated CDV vaccine, CDV-ISCOM vaccine or with one of three different modified life virus (MLV) vaccines. In Study 2, Eurasian otters (n=11) regularly vaccinated against CDV before the onset of this study were evaluated for their CDV-specific virus neutralisation (VN) antibody titre one year after the last vaccination and for their sero-response following booster vaccination. The results were as follows: None of the otters showed clinical signs of CDV infection. Immune response to inactivated CDV vaccine was low. CDV-ISCOM vaccine induced humoral immune response in all otters, but high titres were only measured by ELISA. Vaccination with MLV vaccine revealed that the sero-response in Eurasian otters depended on the vaccine strain used. Age, sex, species and body mass did not influence immune response to MLV vaccine vaccination. The three different vaccine types (inactivated, ISCOM, MLV) showed a significant difference in efficacy with MLV vaccines from Onderstepoort type yielding the best results. There was no difference in geometric mean titres after two vaccinations between the Eurasian otter and Asian small-clawed otter. The fit between the two methods was not very tight. Booster vaccination in Eurasian otters with MLV vaccine (Onderstepoort type) induced a significant rise in VN antibody titres, with VN antibody titres staying on an adequate level for up to day 365 post vaccination. The results led to the following conclusions: The use of formalin-inactivated CDV vaccine containing Al(OH)3 as adjuvant seems at best ineffective and questionable in the tested otter species. Modified live virus CDV vaccines of Onderstepoort type are efficacious in Eurasian otters and Asian small-clawed otters and seem to be safe in these species. The experimental CDV-ISCOM vaccine is safe and might be an efficacious alternative. The ELISA used in this study is useful for screening purposes but is not recommended as an alternative for the VNT.

Staupe, eine hochinfektiöse, systemische Viruserkrankung der Hunde und anderer Karnivoren, wird als die bedrohlichste Infektionskrankheit der Marderartigen betrachtet. In dieser Arbeit wurde die Sicherheit und Wirksamkeit der in Europa verfügbaren Staupeimpfstoffe bei Europäischen Fischottern (Lutra lutra), Asiatischen Kurzkrallenottern (Aonyx cinereus) und ansatzweise bei Nordamerikanischen Fischottern (Lontra canadensis) ermittelt. Zwei Methoden zur Antikörperbestimmung wurden verglichen. Der Referenzstandard zum Antikörpernachweis gegen Morbilliviren ist der Neutralisationstest (NT). Dieser ist zeitaufwendig und teuer. Ein kostengünstiger und schnell durchführbarer ELISA wäre sehr hilfreich. Siebzig Otter, aus 19 verschiedenen Zoos und Tierparks in Deutschland und den Niederlanden, beiderlei Geschlechts und im Alter zwischen 8 Wochen und 17 Jahren wurden geimpft. Zwei Studien wurden durchgeführt. In Studie 1 wurden bisher ungeimpfte Europäische Fischotter (n=27), Asiatische Kurzkrallenotter (n=28) und Nordamerikanische Fischotter (n=4) entweder mit inaktiviertem Staupeimpfstoff, mit CDV-ISCOM Impfstoff oder mit einem von drei verschiedenen Staupe Lebendimpfstoffen geimpft. In Studie 2 wurden die Antikörper (AK) Titer Europäischer Fischotter (n=11), die bisher regelmäßig gegen Staupe geimpft wurden, vor und nach einer Booster Impfung bestimmt. Folgende Ergebnisse wurden ermittelt: Bei keinem der Otter wurden klinische Symptome einer Staupe Erkrankung beobachtet. Die Immunantwort auf inaktivierten Staupeimpfstoff war schwach. CDV-ISCOM Impfstoff führte bei allen Tieren zu einer humoralen Immunantwort, hohe AK- Titer wurden jedoch nur im ELISA gemessen. Die Immunantwort auf Lebendimpfoff zeigte bei Europäischen Fischottern eine Abhängigkeit vom Impfstamm. Alter, Geschlecht, Tierart und Gewicht hatten keinen Einfluss auf die Immunantwort nach Impfung mit Staupe Lebendimpfstoff. Die drei Impfstofftypen (inaktiviert, ISCOM, lebend) zeigten einen signifikanten Unterschied in der Wirksamkeit, wobei Staupe Lebendimpfstoffe vom Onderstepoort Typ sich als am wirksamsten erwiesen. Zwischen Europäischen Fischottern und Asiatischen Kurzkrallenottern gab es keinen Unterschied in der Höhe der neutralisierenden AK-Titer nach zwei Impfdosen. Der Zusammenhang zwischen den zwei Nachweismethoden war nicht sehr stark. Booster Impfung bei Europäischen Fischottern mit Lebendimpfstoff (Onderstepoort Typ) induzierte einen signifikanten Anstieg der neutralisierenden AK, die bis Tag 365 nach Impfung auf einem angemessenen Level blieben. Die Ergebnisse führten zu folgenden Schlussfolgerungen: Der Einsatz der formalin-inaktivierten Staupe Vakzine mit Al(OH)3 als Adjuvant ist bei den getesteten Fischotterarten nicht sinnvoll. Staupe Lebendimpfstoffe vom Onderstepoort Typ sind wirksam bei Europäischen Fischottern und Asiatischen Kurzkrallenottern und scheinen bei diesen Arten sicher zu sein. Der experimentelle CDV-ISCOM Impfstoff ist sicher und wahrscheinlich eine wirksame Alternative. Der in dieser Studie eingesetzte ELISA ist einsetzbar für ein Staupe AK-Screening, wird jedoch nicht als Alternative für den NT empfohlen.