Caracterización de la familia génica de las nucleosidasas en Phaseolus vulgaris

Los nucleótidos son moléculas de vital importancia en todos los seres vivos, ya que, además de ser componentes esenciales de los ácidos nucleicos, participan en procesos bioenergéticos, forman parte de cofactores de enzimas y de segundos mensajeros, y son precursores para la síntesis de metabolitos primarios y secundarios. En plantas, los nucleótidos de purina y de pirimidina pueden proceder de la síntesis de novo, el reciclado de nucleósidos y bases nitrogenadas o pueden absorberse directamente del suelo. Como en la mayoría de animales y microorganismos, el catabolismo de pirimidinas en plantas conlleva la reducción de uracilo y timina hasta CO2, NH3 y β-alanina o β - aminoisobutirato, respectivamente. En cuanto al catabolismo de purinas, las plantas pueden oxidarlas completamente y recuperar el nitrógeno presente en ellas, mientras que la mayoría de los animales no. Otra particularidad del metabolismo de purinas en plantas es su relevancia en las leguminosas ureídicas, ya que la nucleobase xantina es el precursor de los ureidos alantoína y alantoato, moléculas claves en el transporte y almacenamiento de nitrógeno en este grupo de leguminosas. Además, en los últimos años se ha sugerido una conexión importante entre el catabolismo de los ácidos nucleicos y nucleótidos y el de ureidos en distintos procesos en los que se produce una elevada movilización de nitrógeno. Tanto las rutas de síntesis de novo como las de reciclaje de nucleótidos confluyen en la formación de nucleótidos monofosfato, que son los sustratos de las 5’-nucleotidasas, fosfatasas que catalizan el primer paso de la ruta de degradación. Un elemento clave en la ruta de degradación de purinas es la formación del nucleósido xantosina, ya que marca un punto de no retorno en la degradación de purinas, pues no puede ser reciclada. El siguiente paso en la ruta de degradación de purinas y pirimidinas lo catalizan las nucleosidasas (nucleósido hidrolasas, NSH), enzimas que hidrolizan los nucleósidos hasta la base nitrogenada y ribosa, y que se han postulado como enzimas clave en el control del equilibrio entre degradación y reciclaje de nucleótidos. Las nucleosidasas también pueden jugar un papel importante en procesos de señalización, ya que para que el eATP, una molécula señalizadora extracelular, actúe de manera eficiente, debe de poder ser retirado del apoplasto una vez ejerza su función, lo que ocurre por la acción concertada de apirasas y nucleotidasas y nucleosidasas extracelulares. Estas nucleosidasas también podrían participar en la recuperación de nucleósidos del suelo o los que son liberados cuando una célula se daña. El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización de la familia génica de las nucleosidasas en la leguminosa ureídica Phaseolus vulgaris. Para ello, se han clonado los genes que codifican dichas enzimas en judía, lo que ha permitido determinar que dicha familia está formada por, al menos, cuatro genes, dos de localización citosólica (PvNSH1 y PvNSH2) y dos de localización apoplástica (PvNSH3 y PvNSH4). Además, los ORFs de dichos genes se han sobreexpresado en sistemas heterólogos, lo que ha posibilitado la purificación de las enzimas correspondientes y su posterior caracterización. PvNSH1 presenta alta afinidad por nucleósidos de purina y pirimidina, mientras que PvNSH2 parece más específica de purinas y, en particular, de xantosina. En cuanto a las nucleosidasas apoplásticas, PvNSH4 es activa a pH ácido y utiliza, principalmente, inosina como sustrato, mientras que no se ha podido caracterizar la actividad de PvNSH3. Cabe destacar, que el análisis filogenético de las nucleosidasas apoplásticas sugiere que estas enzimas tienen un origen evolutivo relativamente reciente, ya que sólo se han identificado en algunos grupos de plantas, pero no en organismos pertenecientes a otros reinos. Por otro lado, se ha investigado el papel fisiológico de las nucleosidasas en judía. Los resultados obtenidos muestran que PvNSH1 y PvNSH2 juegan un papel relevante durante la germinación y el desarrollo postgerminativo de judía, lo que resalta la importancia del metabolismo de nucleótidos en esta fase de desarrollo. Además, se ha puesto de manifiesto la importancia de estas enzimas en los nódulos de judía, en los que su expresión y actividad es muy elevada, aunque no se ha podido demostrar una relación entre sus niveles y los de ureidos ni en raíces ni en nódulos. En cuanto a las nucleosidasas con posible localización apoplástica, se ha demostrado esta ubicación celular y que PvNSH4 podría estar implicada en situaciones de respuesta a estrés y, en concreto, en aquellas que están mediadas por la hormona metil jasmonato. Por otro lado, no se ha podido obtener información acerca de la función de PvNSH3, ya que se han detectado niveles de expresión muy reducidos y sin cambios significativos en ninguna de las situaciones estudiadas.

Nucleotides are molecules of vital importance in all living organisms, as they are not only essential components of nucleic acids, but also participate in bioenergetic processes, are core element of cofactors and second messengers and are precursors for the synthesis of primary and secondary metabolites. In plants, purine and pyrimidine nucleotides can be originate from de novo synthesis, salvage of nucleosides and nucleobases or can be absorbed directly from the soil. As in most animals and microorganisms, pyrimidine catabolism in plants involves the reduction of uracil and thymine to CO2, NH3 and β-alanine or β-aminoisobutyrate, respectively. Regarding purine catabolism, plants can completely oxidise purines and recover the nitrogen present in them, while most animals cannot. Another peculiarity of purine metabolism in plants is its relevance in ureidic legumes, since the nucleobase xanthine is the precursor of the ureides allantoin and allantoate, key molecules in the transport and storage of nitrogen in this group of legumes. Furthermore, in recent years, an important connection between the catabolism of nucleic acids and nucleotides and that of ureides has been suggested in different processes involving high nitrogen mobilisation. Both the de novo synthesis and nucleotide salvage pathways converge in the formation of monophosphate nucleotides, which are the substrates of 5'-nucleotidases, phosphatases that catalyse the first step of the degradation pathway. A key element in the purine degradation pathway is the formation of the nucleoside xanthosine, as it marks a point of no return in purine degradation, because it cannot be recycled. The next step in purine and pyrimidine degradation pathways is catalysed by nucleosidases (nucleoside hydrolases, NSH), enzymes that hydrolyse nucleosides to the nucleobase and ribose, and which have been postulated as key enzymes in controlling the balance between nucleotide salvage and degradation. Nucleosidases may also play an important role in signalling processes, since for eATP, an extracellular signalling molecule, to act efficiently, it must be removed from the apoplast after exerting its function, which is achieved by the concerted action of apyrases and nucleotidases and extracellular nucleosidases. These nucleosidases may also be involved in the recicling of nucleosides from the soil or those that are released from damaged cells. The main objective of this work has been the characterisation of the gene family of nucleosidases in the ureidic legume Phaseolus vulgaris. For this purpose, the genes encoding these enzymes in common bean have been cloned, which has allowed us to determine that this family is formed by at least four genes, two located in the cytosol (PvNSH1 and PvNSH2) and two located in the apoplast (PvNSH3 and PvNSH4). In addition, the ORFs of these genes have been overexpressed in heterologous systems, which has allowed the purification of the corresponding enzymes and their subsequent characterisation. PvNSH1 has a high affinity for purine and pyrimidine nucleosides, whereas PvNSH2 appears to be more specific for purines and, in particular, for xanthosine. Regarding the apoplastic nucleosidases, PvNSH4 is active at acidic pH and uses mainly inosine as substrate, while the activity of PvNSH3 could not be characterised. It should be noted that the phylogenetic analysis of apoplastic nucleosidases suggests that these enzymes have a relatively recent evolutionary origin, as they have only been identified in some groups of plants, but not in organisms belonging to other kingdoms. On the other hand, the physiological role of nucleosidases in common bean has been investigated. The results obtained show that PvNSH1 and PvNSH2 play a relevant role during germination and postgerminative development, which highlights the importance of nucleotide metabolism at this stage of plant development. Furthermore, the importance of these enzymes in common bean nodules has been demonstrated, in which their expression and activity are very high, although no relationship between their levels and those of ureides in either roots or nodules has been demonstrated. Regarding the nucleosidases with predicted apoplastic localisation, this cellular location has been demonstrated, and that PvNSH4 could be involved in the response to stress and, specifically, in those stresses mediated by the hormone methyl jasmonate. On the other hand, it has not been possible to gain information about the function of PvNSH3, as the levels of expression detected were very low and without significant changes in any of the situations studied.