Estudio parasitológico del pez luna, Mola mola (L.), en el Mediterráneo occidental

The present thesis shows, for the first time, the study of the parasite fauna from sunfish, Mola mola (L.) in the Spanish Mediterranean. To date, this is also the most comprehensive study on the parasites of this fish species worldwide. One hundred and six fish have been collected and analyzed during 2005−2008: 104 from four consecutive samples in La Azohía (Cartagena, Murcia, Spain) and 2 fish stranded in Canet de Berenguer and Almazora (Valencian Community, Spain). Furthermore, 61 fish reared in the L’Oceanogràfic aquarium of the City of the Arts and Sciences, Valencia, captured in La Azohía too, were analyzed during 2004−2009 through the collaborative agreement between the University of Valencia and City of the Arts and Sciences. This study is aimed at the revision of the parasite species identified at taxonomical, developing studies at pathological, ecological and prophylactic level obtaining three sections: (1) to increase the knowledge of the parasite fauna of the sunfish; (2) to study the pathologies associated to the parasites in gill chamber; and (3) to evaluate the effect of the larval cestode Molicola horridus on fish. (1) The study of the parasite fauna of the sunfish revealed that all fish were parasitized with an average of 8 species per fish. Seven species were found in more than 50 % of the fish: (in prevalence order) M. horridus, Cecrops latreilli, Anchistrocephalus microcephalus, Lepeophtheirus nordmanni, Accacladocoelium nigroflavum, Dihemistephanus lydiae and Accacladocoelium petasiporum. Six species (larvae) are, apparently, accidental, with 8.7 % of maximum prevalence. In the majority of the parasite species found the sunfish acts as definitive host. Eight species were found only as larval stage, although sunfish can act as intermediate host in 7 of these species, because Gnathia sp. has a monoxenous life-cycle. More than 60 % of species are specific from the Molidae family or from M. mola. The non-specific species are generalist and cited in a lot of teleosts species. Twenty seven species of metazoan parasites from four phyla, Platyheminthes, Nematoda, Acanthocephala and Arthropoda, have been identified: 10 trematodes, 1 monogenean, 4 cestodes, 1 acanthocephalan, 3 nematodes, 7 copepods and 1 isopod. The diversity of the parasite fauna of M. mola is remarkably increased with this study, as evidenced the identification of 10 species previously not recorded in sunfish. Two of these species are new to science: Gonapodasmiinae n. gen. n. sp. (Trematoda) and Nogaus n. sp. (Copepoda). The other 8 species (Bolbosoma capitatum (Acanthocephala); Anisakis sp. Tipus I, Anisakis sp. Tipus II, Ascarophis sp. (Nematoda); Caligus sp., C. bonito, C. pelamydis (Copepoda) and Gnathia sp. (Isopoda)) are new host records. Gonapodasmiinae n. gen. n. sp. shows traits of the Gonapodasmiinae Ishii, 1935 subfamily but has generic and exclusive traits: i) more than two fused individual, trait not observed in the other species from the Didymozoidae family and ii) ventral sucker present, despite the absence of this structure is, supposedly, a diagnostic character of the subfamily. With Gonapodasmiinae n. gen. n. sp. there are 9 species of didymozoids cited in sunfish. Due to the subtissular locations of the parasites, the egg dispersion would happen through traumatic ruptures of the fish’s skin by predators, cleaner species or scavengers. Nogaus n. sp. shows traits (size and proportions) that do not agree with other species of the same genus, the presence of a rounded-shaped cephalothorax standing out. Only 2 specimens were collected so, for the establishment of a new species, it is necessary to find and to examine more specimens. This is the first record of a species of the genus Nogaus in sunfish. Three species previously recorded in sunfish, Reniforma squamata, Accacoelium contortum and the adult stages of L. nordmanni, have been redescribed: The redescription of the gill didymozoid R. squamata intensifies the validity of the genus Reniforma. This shows traits of the Gonapodasmiinae Ishii, 1935 subfamily, tribe Gonapodasmiini Ishii, 1935, but has exclusive traits: i) complete hermaphroditic individuals fused for the posterior body region, folded in reniform capsules and with neovascularisation; ii) ventral sucker present and iii) ovary and vitellarium not branched. Some of these traits do not appear in the original description and are different from the rest of the species of the genus Gonapodasmius. Additionally, the examination of histological sections of this didymozoid has revealed the presence of tegumentary microvilli not described previously in other species. The redescription of A. contortum adds new contributions to the original description. A. contortum can possess short (1:0.1−0.4) or long (1:1.3−3.5) ventral sucker peduncle, depending on the relaxation level of the specimens, condition that has an influence in the arrangement and location of the vitellarium too. The parasites were located in gills, and digestive tract, as previously reported, and in pharynx too, among the pharyngeal teeth. The redescription of the adult stages of L. nordmanni differs from some traits in the original description: i) proximal segment of the antennules with 25 setae in females and 29 in males; ii) endopod of leg 1 with 2 short setae on distal end; iii) the second segment of leg 3 of females can have 4 setae; iv) cephalothorax of males with dorsal projections; v) internal branch of the apical bifurcation of the male’s antenna half the size of the external branch; vi) basal end of male’s maxilliped with an apical spine; and vii) leg 6 present in males. New information about the biology and ecology of L. nordmanni is provided. Moreover, the parasitic larval stages are described for the first time, finding some interesting peculiarities of these larvae compared with those from other species of the genus Lepeophtheirus. Prevalence and intensity of L. nordmanni are higher than in other species of the genus in natural conditions. Adult females (ovigerous and non ovigerous) of L. nordmanni are mainly located in the bucal cavity and juveniles and adult males on the skin. These adult males showed the “mate guarding” behaviour, also described in many other copepod species. This behaviour consists in the “kidnapping” of larvae by the adult males to guarantee the copulation. Males hold down larvae from all the stages as well as preadult females. This is the first record of copepodids and chalimi I to III held in mate guarding in this genus. The haematophagous feeding habits, mainly in adult ovigerous females, and in adult males and chalimi, has been proved. Morphological and molecular comparisons of two species of acacelid trematodes from the digestive system, Accacladocoelium macrocotyle and A. nigroflavum, have been developed. According to their descriptions, the only difference between them is the extension of the vitellarium but, this difference is controversial because it depends on the contraction level of the specimens. It is suggested, a change of the specific description of A. nigroflavum pointing out that the vitellarium can reach the postovaric region, and that the main difference between the species would be the degree of vitellarium ramification from the pretesticular area. Furthermore, other differences, such as the size of ventral sucker and ovary, can help in the identification of the specimens, especially when the uterus is full of eggs and the vitellarium cannot be observed. Molecular study revealed interespecific divergences that support the separation of both species according to their morphological differences. With the analysis of the sunfish from L’Oceanogràfic aquarium, the different anthelmintic routine treatments have been evaluated. The effectiveness of the treatments is affected with the location of the parasites: i) parasites located within the digestive system are easily removed with the oral administration of anthelmintic (praziquantel, fenbendazole and albendazole); ii) the ectoparasites from gills and skin are removed with fresh water baths; and iii) A. contortum, Molicola horridus and R. squamata are not removed with the anterior methods, because they are sheltered among the host tissues and are not directly exposed to the treatment (oral or bath). (2) The section on pathologies of the gill chamber, explains the study of the pathological effects of three parasitic species cohabiting this fish site. In this location A. contortum, Cecrops latreilli and R. squamata are located. The tissues close to the capsules of R. squamata were not observed to be related to noticeable in histological alterations. The damage related to C. latreilli depended on the stage and sex of the copepod with a more extensive inflammatory response in gills parasitized by adult females. The parasite with more serious injuries was A. contortum, trematode located in gills and pharynx. This fact seems to be due to the adaptation of A. contortum to the external parasitism, despite belonging to the class Trematoda that is mainly composed of endoparasitic species. The specimens of A. contortum would provoke a high inflammatory response that covers and holds them in gills and pharynx. (3) The last section deals with the evaluation of the effect of plerocerci larvae of M. horridus, mainly, in liver, but also in muscle and kidney. Due to the great size of the larvae, with long body projections, different estimators of parasite load were used considering not only the intensity but the biomass (total and relative). Furthermore, a new parasite load estimator was used, “the percentage of hepatic parasitized surface”. This percentage was correlated with the other estimators. This measure makes it possible to estimate the parasitic charge examining the exterior part of the liver, so other studies where the whole liver is necessary are permitted. To detect the harmful effect of M. horridus in fish different estimators of the parasite load (intensity, biomass, density and percentage of hepatic parasitized surface) were correlated with fish condition indexes (hepatosomatic index and condition factor). The hepatosomatic index was calculated in two ways: i) with the whole liver weight (including the parasite weight) and ii) without the parasite weight (named as “healthy hepatosomatic index”). As the mainly location of M. horridus is the liver, a crucial organ in vertebrate physiology, the study was focused in this organ. Significant negative correlations between the condition factor and the percentage of hepatic parasitized surface and between the “healthy” hepatosomatic index and the density of parasites were observed. These results could indicate that the parasite takes up a great part of the liver mass and can decrease the amount of functional hepatic tissue. However, this decrease appears not to affect this organ so much as a higher loss of functional liver would be necessary to cause a noticeable damage. The histological studies realized in the organs affected by M. horridus did not show a great inflammatory response related to the presence of the parasite. Only in kidney the inflammatory response was more patent than in liver and muscle. The preliminary analysis of the effect of the presence of the parasite on the glycogen level at liver revealed that more parasitized fish had slightly lower levels of this polysaccharide. The experimental test of anthelmintic treatments with derivatives from benzimidazole, albendazole and fenbendazole, against M. horridus in liver from sunfish from the L’Oceanogràfic aquarium, revealed that the higher doses of albendazole are effective for removing the microtriches from the surface of the larval cestodes, but not causing the death of the parasite. The fenbendazole doses did not seem effective for removing the microtriches. Fish survival, however, was higher for the low doses of albendazole. Furthermore, this study made it possible to observe, for the first time, bifurcate microtriches in the caudal extensions of the blastocyst of M. horridus, using transmission electron microscopy (TEM).

En el presente trabajo se ha realizado, por primera vez, un estudio de la parasitofauna del pez luna, Mola mola (L.), del Mediterráneo español. Hasta la fecha, se trata del estudio más detallado y completo sobre los parásitos de este pez en todo el mundo. Se han analizado 106 peces durante el período 2005−2008: 104 procedentes de cuatro muestreos consecutivos en la almadraba de La Azohía (Cartagena, Murcia) y 2 varados en Canet de Berenguer y Almazora (Comunidad Valenciana). Además, también se ha tenido acceso a 61 peces luna, de la misma procedencia, mantenidos en el acuario L’Oceanogràfic de la Ciudad de las Artes y las Ciencias de Valencia durante el periodo 2004−2009, gracias al convenio de colaboración entre la Universitat de València y Ciudad de las Artes y las Ciencias S.A., vigente desde 2004 hasta 2010. En este estudio se ha llevado a cabo una revisión de las especies parásitas identificadas a nivel taxonómico, realizándose estudios patológicos, ecológicos y profilácticos dando lugar a tres apartados: (1) parasitofauna del pez luna, (2) patologías de la cámara branquial y (3) efecto de las larvas del cestodo Molicola horridus. (1) Durante el estudio de la parasitofauna del pez luna, se observó que todos los peces luna analizados presentaron parásitos, con una media de 8 especies de parásitos por pez. Siete especies se encontraron en más del 50 % de los peces: (por orden de prevalencia) M. horridus, Cecrops latreilli, Anchistrocephalus microcephalus, Lepeophtheirus nordmanni, Accacladocoelium nigroflavum, Dihemistephanus lydiae y Accacladocoelium petasiporum. Seis especies (todas ellas encontradas en estado larvario) son, aparentemente, accidentales, con un máximo de 8,7 % de prevalencia. En la mayoría de las especies parásitas encontradas, el pez luna actúa como hospedador definitivo. Ocho especies se encontraron solo en fase larvaria, aunque el pez luna podía ejercer de hospedador intermediario en todas menos en Gnathia sp., ya que su ciclo es monoxeno. Más del 60 % de las especies encontradas son específicas de la familia Molidae o de la especie M. mola. Los parásitos no específicos de la especie M. mola o de su familia, son generalistas, citados en muchas otras especies de teleósteos. Se han identificado 27 especies de parásitos metazoos pertenecientes a los filos Platyheminthes, Nematoda, Acanthocephala y Arthropoda: 10 especies de trematodos, 1 monogeneo, 4 cestodos, 1 acantocéfalo, 3 nematodos, 7 copépodos y 1 isópodo. Se ha incrementado la diversidad parasitaria conocida del pez luna en 10 especies. Dos de estas 10 nuevas citas son nuevas especies para la ciencia: Gonapodasmiinae gen. n. sp. n. (Trematoda) y Nogaus sp. n. (Copepoda). Las 8 citas restantes (Bolbosoma capitatum (Acanthocephala); Anisakis sp. Tipo I, Anisakis sp. Tipo II, Ascarophis sp. (Nematoda); Caligus sp., C. bonito, C. pelamydis (Copepoda) y Gnathia sp. (Isopoda)) son nuevas citas de hospedador. Gonapodasmiinae gen. n. sp. n. presenta características propias de la subfamilia Gonapodasmiinae Ishii, 1935, tribu Gonapodasmiini Ishii, 1935, pero, presenta características genéricas y específicas exclusivas: i) puede presentar más de dos individuos fusionados, carácter no observado en ninguna otra especie de la familia Didymozoidae, y ii) ventosa ventral presente, a pesar de que, supuestamente, esta estructura está ausente en toda la subfamilia. El hallazgo de Gonapodasmiinae gen. n. sp. n. aumenta a 9 las especies de didimozoidos conocidas de pez luna. Debido a su ubicación subtisular, la dispersión de los huevos de esta especie podría ser mediada por rupturas traumáticas de la piel de los peces, tanto por especies depredadoras o limpiadoras como por especies carroñeras. Nogaus sp. n. presenta características (tamaño y proporciones) que no corresponden con las de otras especies del mismo género, destacando la morfología redondeada del cefalotórax. Debido a que solo se recolectaron 2 ejemplares sería conveniente obtener y revisar un mayor número de ellos para poder realizar la erección de una nueva especie. Es la primera vez que se cita a una especie del género Nogaus en pez luna. Se han redescrito 3 especies previamente documentadas en pez luna: Reniforma squamata, Accacoelium contortum y los estadios adultos de L. nordmanni. La redescripción del didimozoido branquial R. squamata, refuerza la validez del género Reniforma. Esta especie presenta características propias de la subfamilia Gonapodasmiinae Ishii, 1935, tribu Gonapodasmiini Ishii, 1935, con características exclusivas: i) individuos completamente hermafroditas, fusionados por la parte posterior, plegados en cápsulas reniformes e irrigados por neovascularización; ii) presencia de ventosa ventral; y iii) ovario y glándulas vitelógenas no ramificados. Algunos de estos caracteres no aparecen en la descripción original de la especie y difieren de del resto de especies del género Gonapodasmius. Se han encontrado, además, microvellosidades en el tegumento de estos didimozoidos no descritas previamente en otras especies. Con la redescripción de A. contortum se han realizado nuevas aportaciones a su descripción original. A. contortum puede tener un pedúnculo de la ventosa ventral “corto” (1:0,1−0,4) o “largo” (1:1,3−3,5), dependiendo del estado de relajación de los especímenes, lo que también influye sobre la posición de las glándulas vitelógenas. Además de encontrar a los parásitos en las localizaciones previamente descritas (branquias y sistema digestivo) se han encontrado algunos ejemplares en faringe, entre los dientes faríngeos. La redescripción de los estadios adultos de L. nordmanni difiere en algunos caracteres respecto a la descripción original: i) las hembras presentan 25 setas en el segmento proximal de las anténulas y los machos 29; ii) hay 2 setas cortas en el extremo distal del endópodo del primer apéndice; iii) las hembras pueden presentar 4 setas en el segundo segmento del exópodo del tercer apéndice; iv) los machos tienen proyecciones dorsales en el cefalotórax; v) la rama interna de la bifurcación apical de la antena del macho es la mitad de grande que la rama externa; vi) hay una espina apical en la zona basal del maxilípedo del macho; y vii) el sexto apéndice está presente en los machos. Se aportan también nuevos datos sobre la biología y ecología de L. nordmanni, describiendo además, por primera vez, sus fases larvarias parásitas. Se han encontrado algunas diferencias con las fases de desarrollo de otras especies congenéricas. Los valores de prevalencia e intensidad de L. nordmanni en la zona de muestreo superan los alcanzados por otras especies del género en medio natural. Las hembras adultas (ovígeras y sin huevos) de L. nordmanni se ubican mayoritariamente en la cavidad bucal, mientras que el hábitat de los juveniles y los machos adultos es, casi exclusivamente, la piel. En estos machos adultos se ha observado el comportamiento de vigilia de pareja (mate guarding), descrito en muchas especies de copépodos, consistente en el “secuestro” de larvas por parte de machos adultos para asegurar la cópula. Los machos mantenían en vigilia a larvas de todos los estadios y a hembras preadultas, siendo ésta la primera vez que se citan copepoditos y chalimi I, II y III, en vigilia de pareja en una especie del género Lepeophtheirus. También se ha demostrado la alimentación hematófaga, principalmente en hembras ovígeras, aunque también en machos adultos y estadios chalimi. Se ha realizado el estudio morfológico y molecular de dos especies de trematodos acacélidos del sistema digestivo, Accacladocoelium macrocotyle y A. nigroflavum, cuya única diferencia documentada era la diferente extensión de las glándulas vitelógenas. Esta diferenciación es confusa porque depende del grado de contracción de los ejemplares. Se sugiere cambiar la descripción específica de A. nigroflavum, indicando que las glándulas vitelógenas de esta especie sí pueden alcanzar la región postovárica y que la diferencia principal entre ambas especies sería la mayor o menor ramificación de las glándulas vitelógenas desde la zona pretesticular. Además, existen otras diferencias, como las referentes a las dimensiones de la ventosa ventral o del ovario, que pueden ayudar a su identificación en el caso de que el útero esté lleno de huevos y las glándulas vitelógenas no sean observables. El estudio molecular mostró divergencias interespecíficas suficientes para apoyar la separación de estas especies según su morfología. Tras el análisis de los peces luna del acuario L’Oceanogràfic se han podido evaluar los distintos tratamientos antihelmínticos rutinarios. La efectividad de los tratamientos parece verse afectada por la localización de los parásitos: i) los localizados en el sistema digestivo se eliminan fácilmente con la administración oral de antihelmínticos (pracicuantel, fembendazol y albendazol); ii) los ectoparásitos de branquias y piel se eliminan con baños de agua dulce; y iii) A. contortum, Molicola horridus y R. squamata no se eliminan con ninguno de los dos métodos anteriores (oral o baño), ya que están cobijados entre los tejidos del pez y es difícil que queden expuestos a los tratamientos. (2) En el apartado sobre patologías de la cámara branquial, se ha desarrollado el primer estudio del efecto patológico de las tres especies parásitas ubicadas en esta localización: A. contortum, Cecrops latreilli y R. squamata. Los tejidos próximos a las cápsulas del trematodo didimozoido R. squamata apenas mostraban alteraciones histológicas notables. El daño ejercido por el copépodo C. latreilli dependía del grado de maduración y del sexo, observándose una respuesta inflamatoria más extendida en las branquias parasitadas por hembras adultas. El parásito que llevaba asociadas lesiones de mayor gravedad es el trematodo A. contortum, ubicado tanto en branquias como en faringe. Este hecho podría deberse a la adaptación de A. contortum al parasitismo externo, a pesar de pertenecer a la clase Trematoda, compuesta casi exclusivamente de especies endoparásitas. Los ejemplares de A. contortum provocarían una amplia respuesta inflamatoria en los tejidos circundantes, lo que acabaría por cubrirlos y sujetarlos a dichos tejidos. (3) El último apartado de la presente tesis doctoral es el dedicado a la evaluación del efecto de las larvas plerocerci de M. horridus, ubicadas principalmente en hígado y, en menor medida, en músculo y riñón. Debido al gran tamaño de las larvas de M. horridus, con largas prolongaciones corporales, se utilizaron diferentes estimadores de la carga parásita que integraban no solo la intensidad sino también la biomasa (total y relativa). Además, se utilizó un nuevo estimador de la carga del parásito, “el porcentaje de superficie hepática parasitada”, que resultó estar correlacionado con los otros estimadores. Este último método permite estimar la carga parasitaria examinando el exterior del hígado, por lo que permite desarrollar otros estudios que requieran el órgano intacto. Para detectar el posible efecto nocivo de M. horridus en la salud de los peces se correlacionaron diferentes estimadores de la carga del parásito (intensidad, biomasa, densidad y porcentaje de superficie hepática parasitada) con índices de condición (“salud”) de los peces (índice hepatosomático y factor de condición). El índice hepatosomático se calculó de dos formas: i) teniendo en cuenta todo el peso del hígado (incluyendo al parásito) y ii) excluyendo el peso parásito (este último llamado “índice hepatosomático sano”). Debido a que la ubicación principal de M. horridus es el hígado, un órgano de vital importancia en la fisiología de los vertebrados, el estudio se enfocó primordialmente en este órgano. Se observaron correlaciones significativas negativas entre el factor de condición y el porcentaje de superficie hepática parasitada y entre el “índice hepatosomático sano” y la densidad de parásito. Estos resultados parecen indicar que el parásito ocupa gran parte de la masa del hígado y puede disminuir la cantidad de tejido hepático funcional. Sin embargo, esta disminución podría no afectar de forma sensible a este órgano ya que sería necesaria una pérdida mucho mayor de hígado funcional para que el efecto fuera notable. Los estudios histológicos realizados en los órganos parasitados por M. horridus no mostraron una gran respuesta inflamatoria asociada a la presencia del parásito. Solamente en el riñón se observó una respuesta algo más elevada que en el caso del hígado y del músculo. El análisis preliminar del efecto de la presencia de M. horridus sobre el nivel de glucógeno en los hígados de los peces luna, reveló que los peces más parasitados presentaban una cantidad ligeramente menor de este polisacárido. La prueba experimental realizada con peces luna del acuario L’Oceanogràfic utilizando tratamientos antihelmínticos con derivados del benzimidazol, albendazol y fembendazol, frente a M. horridus del hígado mostró que las dosis más altas de albendazol son efectivas para la eliminación de los microtricos de la superficie de las larvas plerocerci del cestodo, pero no para causar la muerte de dichas larvas. Las dosis empleadas de fembendazol no parecieron ser efectivas para la eliminación de los microtricos. La supervivencia de los peces, sin embargo, era algo mayor para las dosis más bajas de albendazol. Además, este estudio permitió observar por primera vez microtricos bifurcados en las extensiones caudales del blastoquiste de M. horridus, utilizando microscopía electrónica de transmisión (M.E.T).