Trematodes in Mediterranean coastal habitats: Transmission, life cycles and detection Methods

Among metazoan parasites, trematodes (Platyhelminthes) are ubiquitous components in natural systems and widespread in the animal kingdom, thus found in a wide range of conditions and habitats. Understanding their important role in natural ecosystems and the total amount of biomass they account for, contributes to our knowledge on parasites from an ecological point of view. Parasites affect ecosystem processes and play crucial roles in the structure and stability of natural communities and food webs. Furthermore, trematodes are the most common parasites in intertidal soft-sediment habitats, being of major importance in lagoons, a habitat which is characterized by extreme fluctuations in abiotic factors. Lagoons and intertidal habitats gather intermediate and final hosts, so that the transmission of trematode life cycle stages may be facilitated. A wide range of factors play a role in the ecological, physiological and biological peculiarities of each host-parasite system, thus being important in the completion of trematode life cycles. Furthermore, although the Mediterranean is a marine biodiversity hot spot, anthropogenic factors such as pollution, habitat loss and degradation, eutrophication, fishing impacts, discards and climate change affect coastal marine ecosystems and all their organisms, including parasites. This PhD study aims to compile information on various aspects of the life cycles of digenean trematodes, focusing on host-parasite systems common in Mediterranean lagoons, and studying the maturation and emergence of larval stages, their transmission, different methods for the detection of infections, as well as analysing environmental and anthropogenic factors that could enhance the transmission of these parasites. The study led to the following findings and conclusions: The snail Gibbula adansonii (Trochidae) is highly abundant in the intertidal habitat of “Els Alfacs” lagoon (Ebro Delta, Spain) and shows high infection levels with two cotylocercous cercariae, belonging to the family Opecoelidae. They were identified as Macvicaria obovata (Molin, 1859) and Cainocreadium labracis (Dujardin, 1845) and were found to occur in G. adansonii with 23.1% and 22.04% prevalence, respectively. Identification was based on ITS ribosomal DNA sequences and a comparative sequence analysis using published sequences of opecoelid larval and adult stages. Additionally, detailed morphological descriptions of the cercariae were produced, and chaetotaxy reconstruction was performed on images produced by scanning electron microscopy (SEM). This study, together with the examination of the related literature, helped to morphologically differentiate both cercariae from other known opecoelid species infecting gastropods along the Mediterranean and North East Atlantic coasts of Europe, allowing for the elucidation of the life cycle of M. obovata and for the confirmation of the morphotype of C. labracis cercariae. Partial 28S rDNA sequences were provided to aid future studies on systematic relationships within the Opecoelidae. Due to the shallow and confined nature of lagoons, these habitats provide excellent conditions for the transmission of digenean trematodes to their next intermediate hosts. Nevertheless, environmental conditions can greatly fluctuate in these habitats, so that an experimental study was performed, to assess the influence of changing abiotic factors, which exhibit marked fluctuations in lagoonal environments, on the emergence of cercariae of M. obovata and C. labracis. Snails emitting cercariae were exposed to varying temperature, salinity, water levels and photoperiods. Both cercariae use a sit-and-wait downstream host-finding strategy, by which they remain attached to the substrate until they infect small benthic fish, in the case of C. labracis, and snails in the case of M. obovata. The results of the present study indicated contrasting patterns and rates of larval emergence in C. labracis and M. obovata, likely an adaptation to ensure spatial and temporal co-occurrence with their next intermediate hosts. Increasing temperature, low water level and darkness increase the emergence of M. obovata, facilitating the encounter with the nocturnal mollusc C. neritea, probably when tidal pools are formed and cercariae concentrate in a small water volume. On the contrary, daylight hours, a 12-h light: 12-h dark photocycle and increased salinity trigger the emergence of C. labracis, probably to coincide with small gobiids present in the lagoons during the early summer. Both, exogenous control of parasite transmission by these abiotic factors as well as endogenous control associated with the different transmission pathways of both opecoelid cercariae was proven. Trematode communities often consist of different species exploiting the same host population, so that two or more trematodes can co-occur in the same individual host. Multiple infections usually occur in very low prevalences suggesting that within-host competition may be regulating co-infections. The commonly used diagnostic method for the detection of larval trematode infections in snail intermediate hosts is based on cercarial shedding; however, this method has been often criticized as inaccurate, e.g. in comparison with the prevalence obtained by snail dissection. In order to achieve a precise estimation of the prevalence of intramolluscan stages, a species-specific duplex PCR was designed for the detection of single and double infections in two host-parasite systems in the intertidal habitat: i) the two co-occuring opecoelid trematode species in the Ebro Delta lagoon (Spain), for which within-host interactions have never been studied, and ii) two co-occurring trematode species (Maritrema novaezealandensis and Philophthalmus sp) in the snail Zeacumantus subcarinatus (Batillariidae) in intertidal habitats in Otago (New Zealand), with interspecific competition known to occur. The molecular assays were shown to detect between 0.6% and 54.2% more single as well as between 2.4% and 9.5% more double infections, thus showing a higher accuracy than methods based on cercarial shedding. The duplex PCR assay furthermore provides the advantage to be able to differentiate between the morphologically similar opecoelid species co-infecting a single snail host, as well as detecting and identifying immature infections. According to the expected frequency of multiple infections and the comparison with observed prevalences, the higher accuracy of the duplex PCR suggested that double infections were more frequent than expected. However, interspecific competition in double infections may eliminate early infections by the first established species, a scenario likely occurring in Z. subcarinatus. Thus, the frequency of double infections detected by the more sensitive duplex PCR may overestimate that of naturally occurring mature infections resulting from the release of cercariae. Hence these results have to be interpreted with caution and are best considered together with emission rates. A more realistic assessment of the frequency of larval trematodes infecting snails helps us to understand the community structure and potential interspecific interaction within the host. The species-specific ITS-based PCR assay can be extrapolated to other systems and should be considered as an important additional tool for determining prevalences of larval stages with high accuracy. Cercarial development and transmission is affected by many factors, with the host’s distribution being of particular importance. Cercarial release from the first intermediate host has to be temporally and spatially adapted to maximise the encounter with the downstream hosts, especially in sessile cercariae such as those of C. labracis and M. obovata. The development of intramolluscan larval stages and parasite maturation inside sporocysts of these two species was monitored during the spawning-related upshore residency of the snail G. adansonii, i.e. from March to May, by quantifying different maturation stages inside the sporocysts. Furthermore, the effect of sporocyst size and snail size on the number of developmental stages was estimated. Both sporocyst and snail size act as proxies of the reproductive capacity of M. obovata but not that of C. labracis. Surprisingly, we did not observe variation in the number of germinal balls or cercarial embryos in either parasite species, during these months, however, a higher number of mature stages and the highest maturity index (average maturity of each sporocyst) were found in April. Thus, the production of mature cercariae of both species is continuous from March to May, when the snail G. adansonii inhabits the upshore habitat and it coincides with the spawning period of the host and the presence of small benthic fish and the snail C. neritea in the habitat Spawning-related upward migration is common among trochid snails, as well as the manipulation of host behaviour by trematodes, with parasitized individuals changing their geographic distribution to enhance transmission probabilities of the trematodes to the next host. Thus, a link between larval maturation and snail upshore residency during migration can be hypothesised, since the synchronisation of larval and host maturation in time and space guarantees the completion of the life cycle of C. labracis and M. obovata. Thus, this snail-parasite system opens a door to further studies on parasite-induced behaviour changes as a true adaptation for transmission. Trophically-transmitted parasites play an important role in host community structure, exerting strong effect on food web structure when infecting a wide range of host species. However, information on host specificity is often scarce or unavailable. The aim of this study was to extend the knowledge of the host-spectrum and host-specificity of a common parasite in the Mediterranean, the heteroxenous digenean Cardiocephaloides longicollis, considering all host levels, in order to characterise its life cycle ecology. For this, 3351 molluscs (24 species), 2108 fish (25 species), 154 birds (17 species) and 158 faecal samples from birds were screened for C. longicollis. New host records at the first intermediate host level (1 taxon), but especially the second intermediate host level (12 taxa, including two new families) were detected, and, most importantly, considerably higher infection levels than previously reported were detected in first intermediate and definitive hosts. The infection level in fish was highest in autumn and winter, possibly related to a parasite-induced mortality in spring. Demersal and benthic fish seem to be targeted more frequently by cercariae and hence their parasite loads were higher than that of pelagic fish. A cumulative effect of metacercariae over time, i.e. with increasing host size, was observed, in the fish brain. At the same time, a decline of parasite aggregation in the largest fish size classes was detected, thus indicating parasite-induced mortality by which the most infected fish are eliminated from the population. The accumulation of metacercariae of C. longicollis may increase the manipulation of the host behaviour, causing fish to swim in the upper part of the water column, making them more susceptible to predation by the definitive host and thus enhancing their transmission. During this study, high infection rates were found in hosts from areas with high fishing activity, suggesting an enhanced transmission of C. longicollis. Scavengers such as seagulls are attracted by bycatch, i.e. discarded fish, which, in the Mediterranean, is composed of fish sizes and species found to have the highest infection rates. These fish inhabit demersal and benthic habitats and would under natural conditions be less accessible to the birds. Moreover, metacercariae of C. longicollis were found in the gilthead sea bream Sparus aurata from aquaculture installations with 54% prevalence, and it is possible that aquaculture activities impact further on C. longicollis transmission. As a trophically-transmitted generalist species with a complex life cycle that affects a high number of host species, C. longicollis likely has a strong effect on the energy flow through the food web, even under natural conditions. This feature makes C. longicollis an ideal candidate to compare future web structures between natural areas and those impacted by fisheries.

1. Introducción general Los metazoos trematodos (Platyhelminthes) son componentes ubicuos de los ecosistemas naturales entando temporal o permanentemente presentes en más de la mitad de las especies animales (Bush y col. 2001, Prietrock & Marcogliese 2003). Los parásitos trematodos pueden encontrarse en un amplio rango de condiciones y hábitats, teniendo un gran impacto en los procesos ecológicos: mediante la regulación de las poblaciones de hospedadores (Hudson y col. 2006) y afectando a la estructura de las comunidades y redes tróficas (ej. Mouritsen & Poulin 2002, Thompson y col. 2005, Lafferty y col. 2006, 2008). Son sobre todo, los parásitos que son transmitidos a través de la cadena trófica los que afectan a un gran número de especies de hospedadores, condicionan la estabilidad de las redes tróficas, sus interacciones, longitud y flujo de energía (Thompson y col. 2005, Lafferty y col. 2008). .En el Mediterráneo Occidental existe una gran riqueza de especies, encontrándose la mayor diversidad de peces e invertebrados en aguas de la plataforma continental. Las masas de agua de la plataforma continental constituyen el 20% del Mar Mediterráneo, por lo que tienen un papel importante en los procesos ecológicos (Bartoli & Gibson 2007, Coll y col. 2008). Los platelmintos constituyen el 6,7% del total de la diversidad de especies del Mediterráneo, siendo sin embargo poco conocidos, con menos del 50% descritas (Coll y col. 2008). Bartoli & Gibson (2007) aumentaron en gran medida nuestro conocimiento sobre platelmintos trematodos lagunares, al recopilar información sobre 72 especies nominales de lagunas del Mediterráneo Occidental, de las cuales aportaron el ciclo vital completo de 56. Los trematodos son los parásitos más comunes en hábitats intermareales de sedimento blando (Sousa 1991, Mouritsen & Poulin 2002, Poulin & Mouritsen 2006), siendo además de gran importancia en lagunas (Bartoli & Boudouresque 2007). El hábitat intermareal se caracteriza por fluctuaciones extremas de los factores abióticos (Palacín y col. 1991, Koutsoubas y col. 2000), con pequeños cambios en el nivel del agua que, por la evaporación, pueden exponer a los moluscos a altas temperaturas y salinidades elevadas (6°C a 30°C y de 21‰ a 38‰, respectivamente, Solé y col. 2009). Los moluscos, que constituyen del 15 al 25% de la macrofauna bentónica (Coll y col. 2008), son hospedadores de una gran variedad de parásitos, normalmente estados larvales de trematodos digeneos (Lauckner 1980). Las lagunas suelen ser utilizadas como zonas de alimentación y cría de aves y peces, por lo que la transmisión de los estados vitales de los trematodos entre los diferentes hospedadores podría verse facilitada gracias a su proximidad (Bartoli & Prévot 1986, Bouchereau & Guelorget 1998¸ Koutsoubas y col. 2000, Soppelsa y col. 2007). Durante el siglo pasado, las actividades pesqueras han evolucionado desde la producción a pequeña escala a la explotación industrializada y extensiva. Esta evolución de las pesquerías también ha sido evidente en el Mediterráneo. Por otra parte se sabe que tanto las costas marinas como la biodiversidad del Mediterráneo se ven amenazadas por el impacto antropogénico, como el cambio climático o la sobreexplotación (IPCC 2001, Coll y col. 2008). Debido a la mortalidad de organismos intermareales a causa de cambios extremos de temperatura (Harley y col. 2006) y su efecto sobre la abundancia y distribución de estos organismos (Harley y col. 2006, Helmuth y col. 2006), estos hábitats han sido propuestos como sistemas tempranos de alerta para la detección del cambio climático. Además, la alta sensibilidad de los parásitos a los cambios de temperatura y la contaminación también podrían ayudar a monitorizar el impacto ecológico del cambio climático (Marcogliese 2001, Poulin & Mouritsen 2006). Además, los descartes de las pesquerías facilitan el acceso de las aves marinas a grandes cantidades de comida, particularmente peces demersales que de manera habitual serían inaccesibles (Tasker y col. 2000, Oro & Ruiz 1997). Por lo tanto, aunque se conoce el impacto de estas prácticas sobre las poblaciones de hospedadores (ej. en láridos, Oro 1996, Oro y col. 1995, 1996), los efectos sobre la transmisión de los parásitos no se ha estudiado en profundidad. La subclase Digenea (Trematoda) comprende alrededor de 18.000 especies nominales (Cribb y col. 2001, Bartoli & Gibson 2007), lo que representa el mayor número de endoparásitos presentes en todas las clases de vertebrados (Bush y col 2001). La mayoría de los trematodos digeneos tienen un ciclo vital complejo que involucra tres hospedadores y diferentes estados de desarrollo (Galaktionov & Dobrovolskij 2003).Los hospedadores definitivos son por lo general vertebrados (aves o peces). Los huevos maduros se liberan al agua, normalmente a través de las heces, emergiendo una larva ciliada, el miracidio, que infecta al primer hospedador intermediario, por lo general un gasterópodo. Dentro del gasterópodo, los trematodos se reproducen de manera asexual en un esporocisto o redia, dando lugar a un gran número de cercarias que son liberadas al medio una vez maduras. Estos estados de vida libre no se alimentan, y parasitan al segundo hospedador intermediario, generalmente otro molusco o un pez, en un corto período de tiempo (menos de 24 horas). Después de la penetración en el segundo hospedador intermediario, la cercaria se enquista y se transforma en un metacercaria. De manera general, el hospedador definitivo adquiere las metacercarias infectivas a través de la cadena trófica. Cada etapa del ciclo vital del parásito muestra una estrategia de transmisión diferente y específica para completar con éxito el ciclo vital (Combes y col. 2002). Las etapas de vida libre de trematodos, es decir, los huevos, miracidios y cercarias, dependen de sus propios recursos energéticos y están directamente expuestos a los cambios ambientales, lo que condiciona la interacción entre los parásitos y sus potenciales hospedadores. Por lo tanto, los factores ambientales abióticos y bióticos influyen en el éxito de transmisión de los estados larvales de vida libre, en especial de las cercarias durante la búsqueda del siguiente hospedador, alterando su supervivencia o infectividad (Fingerut y col. 2003, Pietrock & Marcogliese 2003, Thieltges y col. 2008). Cabe destacar que los hábitats lagunares están caracterizados por grandes cambios ambientales y una alta heterogeneidad interna. La comprensión de los efectos de estos factores ambientales sobre la emergencia de cercarias es importante para estimar el impacto de las condiciones cambiantes en la transmisión y el ciclo vital de un parásito. Las instalaciones de acuicultura y los descartes provocan que diferentes grupos de hospedadores (peces, Bozzano & Sarda 2002; aves, Oro & Ruiz 1997 y gasterópodos, Morton & Yuen 2000) se concentren en la misma zona, por lo que la transmisión del parásito se ve facilitada. La atracción hacia instalaciones de acuicultura de potenciales hospedadores definitivos, como aves piscívoras (Witt y col. 1981, Arcos y col. 2001, Christel y col. 2012), puede, por lo tanto, intensificar la transmisión de parásitos. El impacto ambiental de las actividades pesqueras e instalaciones de acuicultura hacen que sea primordial estudiar posibles ciclos vitales que podrían verse favorecidos bajo estas condiciones. La coexistencia de dos organismos en un sistema parásito-hospedador se caracteriza por la obtención de beneficios por parte del parásito (ej. energía o espacio) a expensas del hospedador, por lo que un parásito, por definición, afectará a su hospedador de diferentes maneras (Lauckner 1980, 1983, Price 1980). Por lo general, el tamaño del hospedador es un factor importante para los trematodos, existiendo un compromiso entre el número de cercarias que emergen de un gasterópodo y su tamaño, proveyendo más espacio y nutrientes aquellos hospedadores más grandes (Loker 1983, McCarthy y col. 2002, Poulin & Morand 2004). Asimismo, se ha observado en varias especies la existencia de un efecto acumulativo de parásitos relacionado con el tamaño del hospedador (ej. Thomas y col. 1995, Karvonen y col. 2003, Osset y col. 2005). La mortalidad inducida por la acumulación de parásitos, por la cual los individuos más infectados son eliminados de la población (Rousset y col. 1996, Poulin 2001), se ha descrito tanto en peces como en invertebrados. Dada la corta vida de las cercarias, la sincronización de la emergencia tiene que estar optimizada para facilitar la transmisión al siguiente hospedador intermediario (Combes y col. 1994). La distribución de los hospedadores es igualmente importante, existiendo incluso parásitos que manipulan el comportamiento del hospedador en el que se encuentran para aumentar las probabilidades de alcanzar al siguiente hospedador (Poulin 2007). En cualquier sistema, la combinación de varios factores influye en la emergencia del parásito, así como a su transmisión y ciclo vital, teniendo que tener en cuenta la interdependencia de los factores a la hora de estudiar un sistema. La combinación de diferentes técnicas, como el empleo de herramientas moleculares, el desarrollo de experimentos y la implementación de técnicas nuevas para la detección de infecciones, es necesaria para obtener una visión holística del sistema parásito-hospedador estudiado. 2 Justificación y objetivos La presente tesis tiene cuatro propósitos generales: (i) describir un sistema parásito-hospedador común en lagunas del Mediterráneo que se ajusta a las condiciones en el hábitat intertidal, (ii) aumentar el conocimiento sobre los factores que juegan un papel importante en la emergencia, transmisión y desarrollo de las diferentes etapas larvales, (iii) proporcionar nuevas evidencias sobre la mayor precisión de los métodos moleculares para detectar infecciones en gasterópodos, teniendo también en cuenta sus desventajas, y (iv) ampliar nuestro conocimiento sobre el rango de hospedadores y la transmisión de las fases del ciclo vital de Cardiocephaloides longicollis, un parásito digeneo que está altamente presente en el Mediterráneo y que está integrado en sus redes tróficas. Los objetivos específicos a desarrollar son los siguientes: I.- Identificación morfológica y molecular de dos morfotipos diferentes de cercarias emergidas del caracol Gibbula adansonii, común en el hábitat intermareal de la laguna del Delta del Ebro, determinando las tasas de infección, así como su relación filogenética con especies de trematodos cercanas. II.- Evaluación experimental del efecto de los cambios en la temperatura, la salinidad, el fotoperiodo y el nivel de agua sobre la emergencia de larvas de Cainocreadium labracis y Macvicaria obovata, desde su primer hospedador intermediario G. adansonii, mediante técnicas in vitro, en el contexto de sus estrategias de encuentro del siguiente hospedador intermediario. III.- Comparación de métodos tradicionales de detección de infecciones en el primer hospedador intermediario, por emergencia y herramientas moleculares, con una PCR dúplex específicamente diseñada para la detección de estados larvales en gasterópodos, tanto en infecciones simples como dobles. Se utilizarán dos sistemas de parásito-hospedador presentes en el hábitat intermareal: i) dos especies de trematodo, C. labracis y M. obovata, que co-habitan en gasterópodo G. adansonii, desarrollándose en esporocistos y cuya interacción interespecífica no se ha estudiado, y ii) dos especies de trematodo, Maritrema novaezealandensis y Philophthalmus sp. , que co-habitan en el gasterópodo Zeacumantus subcarinatus, desarrollándose en esporocistos y redias, respectivamente, del cual se conoce su competencia interespecífica. IV.- Diferenciación morfológica y cuantificación de los estados larvales de desarrollo en esporocistos, y subsecuente descripción de los patrones de maduración en esporocistos de C. labracis y M. obovata infectando a G. adansonii durante los meses de primavera, cuando este gasterópodo se encuentra en el hábitat intermareal de la laguna del Delta del Ebro. Se determinará si existe un vínculo entre la maduración de las larvas y la migración del gasterópodo. V.- Detección a gran escala de potenciales hospedadores (moluscos, peces y aves) para documentar el espectro de hospedadores y la carga parásita de C. longicollis en el Mediterráneo, determinando también el microhábitat marino al que se dirigen las cercarias, comparando los niveles de infección en peces de diferentes hábitats. VI.- Cuantificación de las metacercarias de C. longicollis en los encéfalos de espáridos para analizar el efecto del tamaño de los peces en su acumulación a lo largo del tiempo, y explorar el papel de los factores antropogénicos como la pesca y la acuicultura, que puedan intensificar la transmisión de metacercarias al hospedador final. 3. Materiales y métodos generales En este resumen los materiales y métodos se describen por separado para cada una de las secciones correspondientes. A continuación se resumen los estudios realizados, estructurados por capítulos. 4. Identificación molecular y morfológica de opecoélidos larvales (Digenea: Opecoelidae) parasitando caracoles prosobranquios en una laguna del Mediterráneo Occidental 4. 1. Introducción Las hábitats costeros de las lagunas mediterráneas son áreas donde se lleva a cabo la reproducción y crecimiento de muchas especies de peces (Franco y col. 2006, 2011, Ribeiro y col. 2006, Verdiell-Cubedo y col. 2007). Además, los parásitos trematodos representan una parte importante de las comunidades marinas de los hábitats intermareales, ya que la naturaleza confinada de las lagunas permite que existan las condiciones propicias para la transmisión de los parásitos con ciclos vitales complejos, es decir, con dos o más hospedadores intermediarios. A pesar de que Bartoli y Gibson (2007) dilucidaron, en su revisión bibliográfica sobre digeneos del Mediterráneo Occidental, el ciclo vital de un total de 56 especies de trematodos, entre las referencias empleadas no existen muchos datos sobre los rasgos morfológicos que podrían ayudar a la identificación de las larvas en futuros estudios. Opecoelidae es una familia de parásitos cosmopolita, con al menos 25 especies parasitando peces marinos en el Mediterráneo Occidental (Bartoli y col. 2005). Sin embargo, sólo se conoce el ciclo vital completo de cuatro de ellas, probablemente por la falta de empleo de técnicas moleculares. Entre los ciclos conocidos se encuentra el de la especie Cainocreadium labracis (Dujardin, 1845) (Maillard 1971, 1974, 1976). En un estudio sobre los digeneos en moluscos de la laguna de “Els Alfacs” en el Delta del Ebro (España), se encontraron infecciones en dos moluscos: Gibbula adansonii (Payraudeau, 1826) (Prosobranchia, Trochidae), que contenía esporocistos con dos morfotipos de cercarias cotilocercas, y Cyclope neritea (L., 1758) (Prosobranchia, Nassariidae), que albergaba metacercarias. Durante el presente trabajo presentamos evidencias moleculares y morfológicas para la identificación de los estados larvales de dos especies de opecoélidos encontrados en dos moluscos. 4. 2. Materiales y métodos Se recogieron un total de 514 G. adansonii y 129 C. neritea en la laguna de “Els Alfacs” (Delta del Ebro, España) desde marzo a julio de los años 2010 y 2011. Después de recoger manualmente los caracoles del sedimento fangoso y sobre las hojas de Zostera noltii Hornemann, 1832, se transportaron al laboratorio en agua marina aireada. Para la extracción de ADN se utilizaron de dos a cuatro cercarias de cada morfotipo y dos metacercarias, fijadas en etanol 100% y disueltas en 300µl de tampón de extracción TNES-urea. Estas muestras se disolvieron durante la noche a 55ºC en 100µg ml-1 de proteinasa K, siguiendo después un protocolo fenol-cloroformo para extracción de ADN (Holzer y col. 2004). El ADN se resuspendió y disolvió en 40µl de agua nanopura durante la noche. Las amplificación del ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo con un termociclador en un volumen final de 30µl, conteniendo ≈0.5 unidades de polimerasa ThermoPrime Plus DNA y el correspondiente tampón (10x), que contiene 1.5mM MgCl2 (ABgene), 0.2 mM de cada dNTP, 0.5µM de cada primer, y aproximadamente 100ng de la muestra de ADN. Se amplificaron y purificaron dos fragmentos de ADN ribosomal: la secuencia completa de la región ITS (ITS1+5.8S+ITS2) y la secuencia parcial de la región 28S. Después de ensamblar las secuencias con Bioedit v7.0.5. (©1997–2005; Hall 1999), las secuencias resultantes de ITS se alinearon con secuencias de otros opecoélidos obtenidas en GenBank (Mafft v5.531 (Katoh y col. 2002), Gblocks v 2.0 (Castresana 2000)). Para estimar la posición de las secuencias generadas en relación a otros miembros de la familia Opecoelidae se llevaron a cabo análisis de Neighbour-joining (NJ) con MEGA5 (Tamura y col. 2011) e inferencia filogénica con máxima verosimilitud (ML) con RAxML (Stamatakis 2006). Se usó el programa FigTree v1.3.1 (Rambaut 2009) para la visualización de los árboles generados. Después de la emisión espontánea de cercarias de los caracoles G. adansonii, se estudió inicialmente la morfología de las cercarias con la tinción in vivo rojo neutro. Después, las muestras se fijaron en etanol al 70% y se tiñeron con carmín alumínico o acetocarmín férrico, se deshidrataron en series de etanol y se clarearon en dimetilftalato, para ser montados en una preparación con bálsamo de Canadá. Las metacercarias encontradas en C. nerita se sacaron del quiste y se estudiaron bajo el microscopio. Se tomaron fotografías con una cámara Leica DC300 acoplada a un microscopio DMR. Para el estudio de cercarias en el microscopio electrónico de barrido (SEM), se fijaron muestras en glutaraldehido al 2.5% o en etanol al 70%. Después de lavar los especímenes con tampón fosfatos 0.1M (pH 7.4), se deshidrataron en series de acetona, se secaron hasta punto crítico con CO2 y se revistieron por bombardeo iónico con oro. Las muestras se estudiaron con un voltaje de aceleración de 4kV (JEOL JSM 7401-F). 4. 3. Resultados Se obtuvieron secuencias completas de ITS ADNr y parciales de 28S ADNr de los dos morfotipos de cercarias emergidas de G. adansonii y de las metacercarias encontradas en C. neritea. Después del alineamiento de las 20 secuencias disponibles de ITS de otros opecoélidos, se seleccionaron las regiones no ambiguas para llevar a cabo el análisis filogenético (con NJ y ML). Los dos análisis revelaron la misma posición relativa de las secuencias nuevas respecto a las más cercanas filogenéticamente: las secuencias del morfotipo pequeño y de la metacercaria encontrada en C. neritea formaron un clado diferenciado, junto a muestras de Macvicaria obovata. El morfotipo grande también formó un clado monofilético separado, junto a secuencias de Cainocreadium labracis, siendo la divergencia en ambos casos inferior a la divergencia interespecífica de los géneros Macvicaria spp. (2,8–11,9%) y Cainocreadium spp. (5,3-9,4%). Se tomaron medidas para la descripción morfológica de los dos morfotipos de cercarias, así como las de los esporocistos que las contenían, y de la metacercaria encontrada en C. neritea. Además, se describió el comportamiento de las cercarias y su patrón de receptores sensoriales, utilizando fotografías con microscopía electrónica de barrido (SEM) para destacar algunos rasgos morfológicos de las dos cercarias, como por ejemplo las papilas que forman parte del sistema sensorial. Dependiendo del mes de muestreo, la prevalencia de C. labracis fue de 17,6-30,8%, mientras que la de M. obovata fue de 0,9-23,1%. Tanto los esporocistos como las cercarias de M. obovata resultaron tener un tamaño menor que los de C. labracis (M. obovata, longitud esporocitos (µm) 600-1650, longitud cercarias (µm) 196-296 (media 248); C. labracis, longitud esporocitos (µm) 900-2377, longitud cercarias (µm) 208-402 (media 294). Ambas cercarias, al tener una cola de tipo cotilocerco, se sujetaron al sustrato después de su emergencia desde G. adansonii, mostrando C. labracis movimientos laterales pendulares, más vigorosos en presencia de luz. Macviacria obovata, con movimientos más lentos, contraía y expandía el cuerpo, balanceándose en presencia de luz. 4. 4. Discusión La identificación de digeneos se suele basar en la morfología de los adultos, siendo la dilucidación de sus ciclos vitales una tarea difícil. Por lo tanto, el uso de herramientas moleculares es de gran ayuda para la identificación de estados larvales. Los estudios de Jousson y otros autores (Jousson y col. 1999, 2000, Jousson & Bartoli 2000, 2001, Bartoli & Jousson 2003) aportaron 17 secuencias de opecoélidos adultos encontrados en peces del Mediterráneo con los que comparar e identificar estados larvales de esta familia. La detallada descripción morfológica junto con los análisis moleculares que se han llevado a cabo, han permitido la identificación de dos opecoélidos que infectan al caracol G. adansonii como primer hospedador intermediario como Macvicaria obovata (Molin, 1859) (morfotipo pequeño) y Cainocreadium labracis (Dujardin, 1845) (morfotipo grande). Además, la metacercaria de C. neritea se identificó como M. obovata, por lo que también sabemos que este parásito especie utiliza a este gasterópodo como segundo hospedador intermediario. Se recopilaron datos de otras cercarias cotilocercas descritas en el Mediterráneo y las costas del Atlántico nororiental, para comparar las principales características. Las cercarias de C. labracis diferían del resto al presentar glándulas de penetración mucho mayores, coincidiendo además con la descripción de Maillard (1971) y Dufour & Maillard (1974). Aunque el número de glándulas de penetración de M. obovata coincide con las de Cercaria linearis Lespès, 1857, exhibe una variación mayor en el límite superior de algunas medidas morfométricas, por lo que harían falta análisis moleculares para confirmar la coespecificidad. Este trabajo ha permitido dilucidar el ciclo vital de M. obovata, ya que su segundo hospedador intermediario era hasta ahora desconocido. Hasta el momento, sólo se conocía el gasterópodo Calliostoma striatum como primer hospedador intermediario de C. labracis, por lo que se han aportado evidencias moleculares para una segunda especie de molusco que actúa como primer hospedador intermediario. Asimismo, se han proporcionado descripciones morfológicas detalladas de los dos estados larvales, siendo además la primera descripción de la cercaria de M. obovata. 5. Mismo hospedador, misma laguna, diferentes vías de transmisión: efectos de los factores exógenos en la emergencia de las larvas de dos parásitos digeneos marinos 5.1. Introducción Las lagunas representan sistemas típicos de hábitats costeros, con pequeños cambios en el nivel de agua. Dada su naturaleza confinada y de sus aguas someras, son hábitats con condiciones propicias para la transmisión de parásitos trematodos. Sin embargo, las lagunas sufren cambios ambientales que afectan sobre todo a los estados de vida libre de los trematodos digeneos. Durante la búsqueda del segundo hospedador intermediario, las cercarias están a merced de los cambios de los factores abióticos. Las estrategias de transmisión adoptadas por las cercarias deben asegurar la sincronización temporal y espacial de los hospedadores intermediarios para aumentar la probabilidad de éxito del ciclo vital (Combes y col. 1994, 2002, Pietrock & Marcogliese 2003). A pesar de la importancia de las cercarias en los ecosistemas marinos, se han llevado a cabo relativamente pocos estudios sobre el efecto de los factores abióticos en la emergencia de éstas desde el primer hospedador intermediario. Por eso, en este estudio se han realizado experimentos para saber el efecto que tienen los cambios de factores abióticos como la temperatura, la salinidad, el fotoperiodo y el nivel del agua. Para eso se han usado las dos cercarias que emergen desde el molusco G.adansonii en una laguna del Mediterráneo Occidental: Cainocreadium labracis y Macvicaria obovata. Ambas cercarias tienen una cola cotilocerca en forma de copa que les permite adherirse a una superficie y esperar a infectar al siguiente hospedador de manera pasiva; peces bentónicos (Gobius niger L.; ver Maillard 1971) en el caso de C. labracis y caracoles (Cyclope neritea (L.); ver Born-Torrijos y col. 2012) en el caso de M. obovata. Dado que comparten el primer hospedador intermediario y la misma estrategia de búsqueda del siguiente hospedador, ambas cercarias deberían exhibir respuestas similares en cuanto al efecto de los cambios de factores abióticos sobre su emergencia desde G. adansonii. De manera contraria, respuestas diferentes indicarían la influencia de factores endógenos (por ejemplo, el agotamiento de sus limitadas reservas energéticas) asociados a las vías de transmisión de los parásitos. 5.2. Materiales y métodos Se recogieron un total de 514 G. adansonii en la primavera del año 2010 en las aguas someras de la laguna “Els Alfacs” (Delta del Ebro). Esta laguna semicerrada está conectada con el Mar Mediterráneo, y tiene una profundidad máxima de 4 metros y una masa de agua de aproximadamente 200 millones de litros cúbicos. Además, está caracterizada por una gran heterogeneidad de los factores ambientales: la superficie de la laguna y las áreas someras sufren cambios diarios de temperatura y salinidad, causados por los cambios en el nivel del agua, la evaporación, las lluvias o las descargas de agua dulce desde los canales de drenaje de los arrozales. Después de mantener los caracoles durante 24h en acuarios en la Unidad de Zoología se comenzó el experimento. Para identificar a los caracoles infectados, se les mantuvo durante 24h a 25ºC y un fotoperiodo de 12h luz: 12h oscuridad. Después de la emergencia de cercarias desde los G. adansonii infectados, se llevó a cabo la identificación de las dos especies de cercarias (Born-Torrijos y col. 2012). Los caracoles infectados se repartieron en placas individuales para el recuento individualizado de las cercarias emergidas de cada caracol cada 24h. Las condiciones control fueron 20ºC, nivel de agua alto, 14h luz:10h oscuridad, y se siguieron los siguientes patrones para las condiciones experimentales: descenso y aumento de temperatura, entre 25ºC y 15ºC (cambios de 5ºC diarios); descenso de salinidad desde 45psu a 35psu y después 25psu; nivel de agua de 3ml (sin cubrir al caracol completamente) y 6ml (cubriendo el caracol completamente); por último, mantenimiento de los caracoles con un fotoperiodo de 12h luz: 12h oscuridad y posteriormente de 15h luz: 9h oscuridad. Estas condiciones se eligieron en base a los cambios naturales que se pueden dar en el hábitat intermareal de una laguna. Las diferencias en el número de cercarias emitidas durante 24h en cada condición experimental se evaluaron con modelos lineales generalizados (GLM) de medidas repetidas ANOVA (RM-ANOVA) (STATISTICA 7.0 (StatSoft, Inc. 1984–2004)). 5.3. Resultados Las dos especies, C. labracis y M. obovata, alcanzaron un máximo de 318 y 1145 cercarias por caracol y día a 20ºC, respectivamente, aunque, de manera general, las dos especies emitieron mayor número de cercarias en temperaturas altas. El patrón de respuesta de ambas cercarias fue diferente dependiendo de la dirección del gradiente de temperatura (aumento o descenso). Mientras que ambas especies mostraron una emergencia disminuida con temperatura descendiente, cuando ésta aumentó, C. labracis no experimentó cambios significativos, mientras que M. obovata mostró un aumento brusco de cercarias emitidas en torno a los 15ºC. La emergencia diaria alcanzó un máximo de 506 cercarias de C. labracis por caracol y día en la salinidad más alta (45 psu), y 660 cercarias de M. obovata en la salinidad más baja (25 psu). La emergencia de cercarias de C. labracis descendió notablemente al bajar la salinidad, mientras que no se observaron diferencias en M. obovata. Aunque la emergencia de C. labracis fue mayor en el nivel de agua alto (756 cercarias por caracol y día), esta diferencia no resultó significativa respecto al número emitido durante el nivel de agua bajo. Por el contrario, M. obovata emergió significativamente en mayor número durante el nivel de agua bajo (832 cercarias por caracol y día). La respuesta de las dos especies a los cambios de fotoperiodo fue diferente: C. labracis emergió en mayor número durante el fotoperiodo de 12h luz: 12h oscuridad, sobre todo durante el día, mientras que M. obovata no mostró diferencias significativas entre los dos fotoperiodos, aunque su emergencia fue mayor durante los períodos de oscuridad. 5.4. Discusión Hasta donde conocemos, este es el primer estudio en documentar experimentalmente los efectos de las variaciones de los factores ambientales característicos de las lagunas sobre la emergencia de cercarias, y el primero en examinar especies de digeneos con ciclos vitales complejos, pero con limitada capacidad de dispersión. Las dos especies comparten ciertas similitudes, como el primer hospedador intermediario, el hábitat lagunar, la proximidad filogenética y su estrategia de búsqueda del siguiente hospedador intermediario mediante la fijación al sustrato. Sin embargo, y en contra de nuestras expectativas iniciales, los resultados muestran que las cercarias exhiben respuestas diferentes a la variación de los factores ambientales. Las temperaturas altas suelen afectar al desarrollo de estados embrionarios y por lo tanto a la emergencia y transmisión de parásitos (Galaktionov & Dobrovolskij 2003, Poulin 2006). El descenso de las temperaturas podría acarrear efectos contrarios, sin embargo no ha sido demostrado experimentalmente. En general, la emergencia de cercarias en respuesta a cambios rápidos de temperatura parece estar bajo control exógeno en M. obovata, de manera similar a otras especies (Mouritsen & Jensen 1997, Mouritsen 2002, Thieltges & Rick 2006, Koprivnikar & Poulin 2009, Studer y col. 2010, Prinz y col. 2011). La falta de respuesta de C. labracis al aumento de la temperatura podría deberse al agotamiento de las cercarias maduras listas para emerger. Estudios previos han demostrado la tolerancia de cercarias marinas a un rango amplio de salinidades dependiendo de la especie (Stunkard & Shaw 1931, Prokofiev 1999, Mouritsen 2002). Cainocreadium labracis emergió en menor número con salinidades bajas, mostrando así un control exógeno y su adaptación a niveles altos de salinidad, mientras que M. obovata, al no mostrar cambios significativos, parece mejor adaptada a la salinidad variable de la laguna, en especial a las salinidades bajas alrededor de zonas de afluencia de agua dulce. Dada su estrategia de las cercarias de esperar fijadas al sustrato hasta el contacto con su siguiente hospedador intermediario, la dispersión de ambas especies no depende de los cambios en el nivel del agua. De esta manera, C. labracis no mostró cambios significativos con los cambios en el nivel del agua, probablemente debido a que su siguiente hospedador intermediario son peces bentónicos que permanecen durante todo el año en la laguna, como los góbidos. En el caso de M. obovata, el siguiente hospedador intermediario es el caracol C. neritea, que permanece al bajar el nivel del agua, por lo que la concentración de cercarias en un volumen de agua pequeño favorece el encuentro con estos caracoles. Ambas cercarias mostraron ritmos circadianos de emergencia con control endógeno, pero tasas de emergencia diferentes durante los períodos de luz y oscuridad. La mayor emergencia de C. labracis durante el día está relacionado con la mayor actividad de los peces, mientras que M. obovata emerge más durante la noche, cuando los caracoles C. neritea son más activos. Por lo tanto, este estudio ha demostrado patrones contrarios en la emergencia de las dos cercarias dependiendo de los cambios de factores exógenos simulando las condiciones ambientales de las lagunas. Las cercarias de M. obovata exhibieron un aumento de las tasas de emergencia con temperatura elevada, disminución de la salinidad y nivel de agua bajo, mientras que la emergencia de las larvas de C. labracis no se vio afectada por la variación de la temperatura ni el nivel de agua, y mostró una disminución de su emergencia a niveles bajos de salinidad. Estos resultados muestran la complejidad de los patrones bajo control exógeno que influyen tanto en la transmisión del parásito como en su abundancia. Asimismo, los diferentes ritmos de emergencia de cercarias indican un control endógeno asociado a las diferentes vías de transmisión de estos dos opecoélidos. 6. Estimación de la prevalencia de trematodos en caracoles hospedadores usando una PCR dúplex de un solo paso: ¿cuánto subestima la emergencia de cercarias las tasas de infección? 6.1. Introducción Las comunidades de trematodos normalmente abarcan diferentes especies que explotan una misma población de caracoles, con dos o más especies coexistiendo en el mismo hospedador individual (Sousa 1993, Kuris & Lafferty 1994). La prevalencia de infecciones múltiples es normalmente baja, sugiriendo que pueden darse mecanismos de competencia interespecífica que limiten la coexistencia de las especies en un mismo hospedador. Otros mecanismos, como la supresión de los mecanismos de resistencia del caracol (Sousa 1992) o su fisiología pueden impedir o predisponer a algunos moluscos a ser infectados (Ewers 1960). Por lo tanto, cualquier inferencia sobre las interacciones interespecíficas o la estructura de las comunidades de trematodos en caracoles hospedadores depende de métodos precisos para detectar infecciones en caracoles. Uno de los métodos más habituales para la detección de infecciones larvales en el primer hospedador intermediario es la emergencia de cercarias. Los caracoles se colocan en pocillos individuales y se incuban con una iluminación y temperatura constantes; después de la emergencia de cercarias, éstas se identifican y se calcula su prevalencia. Para aumentar la precisión, algunos autores además diseccionan los caracoles (Gambino 1959, Studer & Poulin 2012b). Sin embargo, este método clásico ha sido calificado como impreciso por varios autores (DeCoursey & Vernberg 1974, Curtis & Hubbard 1990, Cucher y col. 2006, Martínez-Ibeas y col. 2011, Studer & Poulin 2012b), ya que cuando se han comparado prevalencias obtenidas por emergencia de cercarias y por disección de los caracoles, las primeras han resultado estar subestimadas (Miller & Northup 1926, Cucher y col. 2006, Martínez-Ibeas y col. 2011, Lambert y col. 2012), incluyendo las infecciones múltiples e infecciones inmaduras (Stunkard & Hinchliffe 1952, Vernberg y col. 1969, Curtis & Hubbard 1990). Para cuantificar la subestimación de la prevalencia de trematodos, en este estudio se han utilizado dos sistemas de parásito-hospedador con infecciones dobles, comparando, por primera vez, la prevalencia determinada por emergencia de cercarias con la aquella obtenida por métodos moleculares. Se desarrolló un método de PCR dúplex capaz de diferenciar entre infecciones simples (una de las especies) y dobles (dos especies en la misma muestra). Los dos sistemas utilizados son: (i) Muestras del Ebro (España), con las especies Cainocreadium labracis y Macvicaria obovata (Opecoelidae), que se desarrollan en esporocistos en la glándula digestiva y gónadas del caracol Gibbula adansonii (Trochidae). La prevalencia de C. labracis en el Delta del Ebro varía entre 17,6 y 30,8%, mientras que la de M. obovata varía de 0,9% a 23,1% (Born-Torrijos y col. 2012). (ii) Muestras de Otago (Nueva Zelanda), con las especies Maritrema novaezealandensis (Microphallidae) y Philophthalmus sp. (Philophthalmidae), que infectan al caracol Zeacumantus subcarinatus (Batillariidae). La prevalencia de M. novaezealandensis, que desarrolla esporocistos en las gónadas, varía entre 5 y 80% (Studer & Poulin 2012b, Martorelli y col. 2004, Keeney y col. 2008), mientras que Philophthalmus sp., que desarrolla redias en la glándula digestiva y gónadas, varía de menos de 5% hasta casi 30% de prevalencia (Studer & Poulin 2012b). La prevalencia de infecciones dobles de normalmente inferior a 2% (Studer & Poulin 2012b). 6.2. Materiales y métodos Se recolectaron G. adansonii en la laguna de "Els Alfacs" (Delta del Ebro, España) y Z. subcarinatus en las bahías de "Lower Portobello" y "Oyster" (Otago, Nueva Zelanda). Se incubaron los caracoles con las condiciones propicias para la emergencia de cercarias y se identificaron para calcular su prevalencia, obtenida por "el método clásico". Estos mismos caracoles se diseccionaron y se fijaron la glándula digestiva y las gónadas en etanol al 100% para el segundo método de detección, el método "PCR dúplex". Para el diseño de primers específicos para cada especie se utilizaron secuencias de las regiones de ITS. En el caso de C. labracis [Genbank JQ694148] y M. obovata [GenBank JQ694145] se utilizaron las publicadas en Born-Torrijos y col. (2012), mientras que para las dos especies de cercarias de Otago se produjeron secuencias nuevas. Después de la extracción de ADN mediante un protocolo con Chelex, se llevaron a cabo reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) con los primers 3S (Morgan & Blair 2008) e ITS2.2 (Cribb y col. 1998). Las muestras de ADN se secuenciaron y se alinearon con Bioedit v7.0.5 (©1997–2005) (Hall 1999), y más tarde se les asignó un número de acceso de GenBank [M. novaezealandensis KJ540203 y Philophthalmus sp. KJ540204]. Se diseñaron primers específicos para las cuatro especies de cercaria, comparando sus secuencias con secuencias de otros taxones cercanos, para así identificar regiones variables que permitan la identificación específica y a la vez se diferencien de otras especies cercanas. Con el programa Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000) se eligieron las características para los primers, tanto los iniciadores (“forward”) como los inversos (“reverse”). Los primers se diseñaron para generar secuencias de diferentes longitudes para cada especie. Por lo tanto, después de hacer la PCR dúplex con los 4 primers correspondientes a las muestras del Ebro o Otago (2 primers “forward” más 2 “reverse”), las bandas permitieron diferenciar las dos especies visualizando el gel de agarosa hecho, diferenciando las infecciones simples (solamente muestran la banda correspondiente a la infección con una especie) de las dobles (se observan dos bandas de dos tamaños diferentes, correspondientes a las dos especies). Los resultados de las prevalencias obtenidas mediante el método clásico y el método de la PCR dúplex se transformaron en tablas bidimensionales de contingencia (2 x 2) para evaluar estadísticamente las diferencias con un test McNemar Chi-cuadrado para proporciones emparejadas (χ2, P-valor <0,05) (R, paquete stats, versión 2.15.0) (Agresti 1990). Además, se calculó el Coeficiente kappa de Cohen (“Cohen’s kappa statistic”) (K, P-valor <0,05) para evaluar el grado de concordancia entre ambas técnicas (R, paquete FMSB, versión0.4.1) (Nakazawa 2013). 6.3. Resultados La tendencia generalizada en los dos sistemas de parásito-hospedador fue una prevalencia mayor detectada con el método de la PCR dúplex en comparación con el método clásico. Dependiendo del año de muestreo (2011 frente a 2013), se aumentó entre 17,9% y 60,1% la detección del número de caracoles infectados de las muestras del Ebro usando el método molecular. En las muestras de Otago, la diferencia entre prevalencias basadas en el método clásico y PCR dúplex no era tan pronunciada, aunque sí importante, con el 9,9% y el 20,6% más de las infecciones detectadas por PCR, dependiendo del sitio de muestreo (bahías de “Lower Portobello” y “Oyster”). Las estimaciones de la prevalencia de las infecciones fueron significativamente mayores con el método de PCR dúplex en la mayoría de las muestras (7 de 12), siendo el aumento de la detección entre 0,6% y 54,2% para infecciones simples y 2,4% a 9,5% para infecciones dobles. Los valores de Kappa indicaron de manera general una concordancia de razonable a sustancial entre el método clásico y el molecular (22% a 78% de concordancia). Es importante destacar que estos valores fueron más altos para las muestras de Otago en comparación con las del Ebro (más concordancia), y que entre las infecciones dobles había menos concordancia entre métodos en comparación con las infecciones simples. 6.4. Discusión Hasta donde llega nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en el que han sido diseñados primers específicos para usar en una PCR dúplex para la evaluación precisa de infecciones simples y dobles con una muestra ciega de tejido de caracol. El porcentaje de muestras de PCR positivos no detectados previamente por emisión de cercarias es alto, especialmente para las infecciones dobles. Las diferencias entre prevalencias obtenidas por el método clásico y de PCR dúplex, estadísticamente comparadas, demuestran una mayor precisión de la detección molecular sobre el método clásico. El método clásico puede pasar por alto infecciones inmaduras, subestimando así la prevalencia verdadera. La diferencia entre los métodos de detección fue mayor en las muestras del Ebro, mostrando también una gran variabilidad entre años (17,9% en 2011 frente al 60,1% en 2013), que podría deberse a infecciones inmaduras de C. labracis durante el 2013, no detectadas por el método clásico. La diferencia porcentual entre los dos métodos en las muestras de Otago (9,9% en bahía “Lower Portobello” y 20,6% en bahía “Oyster”) destaca las diferentes prevalencias de infección entre los dos sitios de muestreo, como ya se había sugerido con anterioridad (Martorelli y col. 2008). Un hallazgo notable es la mayor detección de infecciones dobles con el método de PCR, probablemente debido a la detección fallida de infecciones inmaduras con el método clásico, ya que las cercarias no emergen del caracol y sólo se contabilizan con el método molecular. Además, la PCR dúplex evita errores de identificación en el caso de especies morfológicamente similares que infectan al mismo hospedador, como es el caso de las dos cercarias de las muestras del Ebro. Por el contrario, la concordancia entre los dos métodos en las muestras de Otago es mayor, lo que confirma que se trata de especies fáciles de diferenciar. Sin embargo, esta concordancia no es perfecta, por lo que se demuestra que incluso en el caso de especies morfológicamente diferentes, el método de la PCR dúplex muestra una mayor detección. No obstante, la interpretación de la mayor sensibilidad en el caso infecciones dobles debe hacerse con cautela, debido a posibles infecciones que se pierden después de un breve período de coexistencia en el caracol, por ejemplo a raíz de competencia interespecífica. Este estudio basado en una PCR dúplex para la detección de regiones ITS específicas, con el objetivo de calcular prevalencias 'verdaderas', puede ser extrapolado a otros sistemas, incluso aquellos que incluyen más de dos especies de parásitos. Este método podría ser considerado por lo tanto como una herramienta adicional para determinar con gran exactitud la prevalencia de estados larvarios. Además, los resultados presentados nos permiten una mayor comprensión de la estructura de la comunidad de larvas de trematodos en caracoles, motivando así la revisión de anteriores conclusiones basadas en estudios de emisión de cercarias, en relación con la competencia interespecífica en infecciones mixtas, parámetros poblacionales de parásitos (prevalencia e intensidad en caracoles infectados) o fluctuaciones estacionales de larvas en caracoles. 7. Patrones de maduración de trematodos en un caracol hospedador migratorio: ¿Qué sucede durante su permanencia en el hábitat intermareal en una laguna mediterránea? 7.1. Introducción Los gasterópodos son un componente importante de las lagunas europeas, donde actúan como primer hospedador intermediario de muchas especies de trematodos (Torchin y col. 2002, Bartoli & Boudouresque 2007, Bartoli & Gibson 2007). Durante el ciclo complejo de los trematodos digeneos, el primer hospedador intermediario, normalmente un gasterópodo, alberga esporocistos en cuyo interior, mediante reproducción asexual, se desarrolla un gran número de cercarias. Éstas, una vez maduras, emergen del gasterópodo para infectar, en un plazo corto de tiempo (de horas a días), al segundo hospedador intermediario, normalmente otro molusco o un pez, donde formarán una metacercaria antes de ser consumidos por el hospedador definitivo. Las vías de transmisión y los factores que afectan a la emergencia y dispersión de las cercarias se han estudiado en profundidad, al igual que la heterogeneidad espacial y estacional de las cercarias (Lang & Dennis 1976, Hughes & Answer 1982, Curtis 1987, Bao-Zhen y col. 1997, McCurdy y col. 2000, Miura & Chiba 2007, Thieltges 2007, Born-Torrijos y col. 2014a; Pietrock & Marcogliese 2003 y Thieltges y col. 2008 para revisiones). Sin embargo, aunque sí que existen descripciones detalladas de las generaciones partenogenéticas dentro de esporocistos (ej. Touassem & Théron 1986, Dobrovolskij y col. 2000), la información sobre la variación de las proporciones de estados de desarrollo en el tiempo es escasa (Korniychuk 2008, Fermer y col. 2010, Prinz y col. 2010), a pesar de su importancia en el contexto de la transmisión de los parásitos. Cada asociación parásito-hospedador se ve afectada por las peculiaridades ecológicas y fisiológicas de cada especie (Gorbushin & Levakin 1999). El parásito puede ocupar o incluso destruir el tejido reproductivo del hospedador, castrándolo, por lo que la energía destinada a reproducción podría desviarse hacia el crecimiento somático del caracol (Baudoin 1975, Poulin 2007) o en beneficio propio del parásito, afectando así su rendimiento reproductivo o desarrollo (Cort y col. 1954, Baudoin 1975, Gérard y col. 1993, Poulin 2007). Para entender los patrones y ciclos de maduración de las larvas en un hospedador intermediario en relación a su transmisión a los siguientes hospedadores, se analizaron los estados larvales y patrones de maduración de Macvicaria obovata y Cainocreadium labracis (Opecoelidae) en el gasterópodo Gibbula adansonii (Trochidae) durante la primavera, período en el que éste se encuentra en el hábitat intermareal de la laguna “Els Alfacs” en el Delta del Ebro. Ambas cercarias poseen una cola cotilocerca con la que se fijan al sustrato para esperar a que el segundo hospedador intermediario se acerque o deprede sobre ellas para infectarlo (estrategia “sit and wait”, ver Born-Torrijos y col. 2014 a). Estos segundos hospedadores intermediarios serían pequeños peces bentónicos en el caso de C. labracis y gasterópodos en el caso de M. obovata. Dada la baja movilidad de las cercarias, el primer y segundo hospedador intermediario deben estar sincronizados espacial y temporalmente, siendo a veces esencial el desplazamiento del caracol para optimizar el éxito de la transmisión del parásito. Las migraciones relacionadas con el desove son comunes en los gasterópodos de la familia Trochidae (Williams 1965, Underwood 1973, Kendall y col. 1987), al igual que la manipulación del caracol por parte de trematodos para modificar su microhábitat, aumentando así sus probabilidades de transmisión (Curtis 1987, 1993, Lowenberger & Rau 1994, McCarthy y col. 2000, McCurdy y col. 2000, Miura & Chiba 2007, Averbuj & Cremonte 2010); esto sugiere una posible relación entre la maduración de las larvas y la residencia del caracol en el hábitat costero durante su migración. Asimismo, se estudió la relación entre el tamaño del hospedador y de los esporocistos y el número total de estados larvales, dado su importante papel en el éxito reproductivo de los trematodos. Los resultados obtenidos se discutirán en el contexto de la coexistencia espacial y temporal del primer y segundo hospedador intermediario para la transmisión exitosa de estas cercarias sésiles. 7.2. Material y métodos Se recolectaron caracoles G. adansonii en el hábitat intermareal de la laguna “Els Alfacs” del Delta del Ebro, con muestreos mensuales en los años 2011 y 2013, recogiendo hasta 600 G. adansonii (8,02 ± 1,26 mm (5,73-11,83)) durante marzo, abril y mayo, meses en los que los caracoles abundan. Durante el resto del año sólo se encontraron ocasionalmente caracoles (<3mm de altura) sin emergencia de cercarias, por lo que probablemente pertenecieran a la nueva generación. Se diseccionaron caracoles escogidos al azar para observar la glándula digestiva y las gónadas bajo la lupa, midiendo antes la altura de la concha (0,1 mm de error). Sólo se incluyeron infecciones simples, confirmadas por el método descrito en Born-Torrijos y col. (2014b), y dependiendo de la carga parasitaria, se seleccionaron aleatoriamente de 5 a 25 esporocistos. Bajo el microscopio se contabilizó el número de estados de desarrollo que contenían los esporocistos, siguiendo las categorías propuestas por Prinz y col. (2010) y Fermer y col. (2010), es decir: (1) bolas germinales, (2) embriones de cercarias en diferentes estados de desarrollo, y (3) cercarias maduras Se midió la longitud de esporocistos de una submuestra, usando imágenes con el programa ImageJ (v 1.44, National Institutes of Health, USA). La maduración está determinada por el embrión más avanzado (Rakotondravao y col. 1992), por lo que para tener una idea intuitiva que resuma la madurez de cada esporocisto, ponderando los diferentes estados de desarrollo, se calculó un índice de maduración (IM = ((No. Cercarias maduras x 3) + (No. Embriones de cercaria x 2) + (No. Bolas germinales x 1)) / (No. total de estados larvales en el esporocisto). Se evaluó el efecto de la infección sobre el tamaño del caracol, comparando caracoles infectados (C. labracis y M. obovata) y no infectados mediante un modelo lineal. Después, se usaron una serie de modelos (Capítulo 7, Fig. 1, ii-x): modelos lineales para comprobar si existen diferencias interespecíficas en el número total de estados larvales dependiendo del tamaño del caracol o del esporocisto (como indicadores de la capacidad reproductiva de cada especie); modelos lineales separados por especies para ver el efecto del tamaño del esporocisto sobre el IM, y el efecto de los meses sobre el tamaño del caracol o la longitud del esporocisto. Por último se hicieron modelos lineales mixtos para ver el efecto del mes sobre el IM, el número de estados maduros, el número de embriones de cercarias o el número de bolas germinales. La identidad del caracol se usó como factor aleatorio, usando medidas repetidas de caracoles individuales. En los análisis en los que se hicieron comparaciones entre meses, se llevaron a cabo comparaciones múltiples de Tukey (R, paquetes lme4 y multcomp, Hothorn y col. 2008, Bates y col. 2014). 7.3. Resultados Después de la confirmación molecular del estatus de infección, se incluyeron 36 caracoles infectados con C. labracis (407 esporocistos) y 15 con M. obovata (202 esporocistos). La mayoría de los caracoles infectados (90,2%, 46/51) contenían los tres estados de desarrollo. El tamaño medio de caracoles infectados con M. obovata era un 14,6% significativamente mayor que aquellos infectados con C. labracis (P-valor<0,01), y un 15% mayor que los caracoles sin infección (P-valor=0,49). El tamaño del caracol y la longitud de los esporocistos mostraron una correlación positiva con el número total de estados de M. obovata, actuando así como indicadores de su capacidad reproductiva (P-valor=0,01, P-valor=0,03, respectivamente). Esta relación no fue significativa para C. labracis (P-valor>0,05). Los modelos lineales no identificaron ninguna variación, en ninguna de las especies, del IM con la longitud de los esporocistos, ni variaciones entre meses en el tamaño del caracol o de los esporocistos (P-valor>0,05). Los modelos lineales mixtos revelaron que el IM de C. labracis y M. obovata aumentó significativamente en abril (P-valor=0,02 en ambos casos). Sin embargo, sólo el número de estados maduros de C. labracis aumentó en abril (P-valor=0,046). Los embriones de cercarias y las bolas germinales no mostraron diferencias significativas entre meses para ninguna de las dos especies. La proporción de la variación explicada por el efecto del caracol en los modelos lineales mixtos fluctuaba entre 13 y 67%. 7.4. Discusión Las condiciones ambientales, al igual que el parasitismo, afectan al crecimiento del caracol, siendo cada sistema de parásito-hospedador diferente (Fernandez & Esch 1991, Gorbushin & Levakin 1999). El mayor tamaño de los caracoles infectados con M. obovata en comparación con caracoles no infectados, sugiere que después de la castración del hospedador, la energía antes destinada a su reproducción se destina al crecimiento somático del caracol, como pasa en otras especies (Baudoin 1975, Sousa 1983, Poulin 2007). Por el contrario, los caracoles infectados con C. labracis no se diferencian en tamaño de los no infectados, por lo que podrían destinar esa energía a otras funciones, demostrando que el reparto de la energía es diferente en cada especie (Sousa 1983, Fernandez & Esch 1991, Gorbushin & Levakin 1999). El espacio y alimento disponible en el caracol limita la capacidad reproductiva de los esporocistos (Cort y col. 1954, Gérard y col. 1993, Poulin 2007), por lo que el uso de la energía está también relacionado con el éxito reproductivo del parásito. El tamaño del esporocisto, y del caracol especialmente, está relacionado con la capacidad reproductiva de M. obovata, por lo que esta especie aprovecha los mayores recursos de los caracoles grandes en su propio beneficio. Sin embargo, esta relación no se encuentra en C. labracis, cuyos esporocistos y cercarias son mayores que los de M. obovata (Born-Torrijos y col. 2012), por lo que su desarrollo es más costoso. Al infectar caracoles más pequeños sufre una constricción espacial que limita su capacidad reproductiva (Rakotondravao y col. 1992, McCarthy y col. 2002). Se esperaba una relación entre el IM y la longitud de los esporocistos, dado que los esporocistos más grandes y maduros suelen contener cercarias maduras (Byrd 1954, Fermer y col. 2010). Sin embargo, esta relación no se detectó, probablemente por un efecto de “vaciado” del esporocisto después de la emergencia de cercarias, así como posiblemente por la simplicidad de la fórmula empleada para calcular el IM. Además, la alta variabilidad de los estados de desarrollo y el IM entre diferentes esporocistos podría provocar que algunos patrones no sean detectados. El tamaño de los caracoles no varía entre meses, por lo que se trata de individuos adultos que han sido infectados repetidas veces, desarrollando así infecciones maduras. En especies donde no se ha encontrado variación temporal en el tamaño del esporocisto o en el número de estados de desarrollo, se ha sugerido la existencia de un período prepatente de infección corto, lo que explicaría la ausencia de diferencias entre meses en el tamaño de los esporocistos de las especies estudiadas. La mayoría de caracoles (90,2%, 46/51) contenía los tres estados de desarrollo simultáneamente, y ningún esporocisto contenía únicamente bolas germinativas, apoyando la idea de una maduración rápida de las cercarias. El número de estados maduros de C. labracis y M. obovata, así como su IM, fueron mayores en abril, y no se detectaron diferencias en el número de cercarias inmaduras ni de bolas germinativas. Esto podría indicar la existencia de un equilibrio entre estados larvales maduros y la formación de nuevos embriones, permitiendo así la producción continuada de cercarias maduras durante la residencia de G. adansonii en el hábitat intermareal de la laguna en los meses de primavera. La eficiencia de este mecanismo debe contemplarse en relación a la estrategia de transmisión de las dos cercarias sésiles, ya que el primer y segundo hospedador intermediario deben coincidir temporal y espacialmente para completar su ciclo vital. Los moluscos intermareales suelen llevar a cabo migraciones con fines reproductores (Fretter & Graham 1962, Williams 1965, Desai 1966, Underwood 1973, Kendall y col. 1987). Además, las aguas someras fuerzan la proximidad de los hospedadores al sedimento, permitiendo que las cercarias les infecten. En este caso, los siguientes hospedadores habitan las aguas someras de lagunas durante los meses de primavera, ya que los peces bénticos pequeños (segundo hospedador intermediario de C. labracis) las usan para desovar (Arruda y col. 1993, Ribeiro y col. 2012, Bouchereau & Guelorget 1998), mientras que el gasterópodo C. neritea (segundo hospedador intermediario de M. obovata) se encuentra en la parte superior del hábitat intermareal (Koutsoubas y col. 2000, Bachelet y col. 2004). Anteriormente, se han observado especímenes infectados con cercarias modificando su distribución vertical para favorecer su transmisión (Curtis 1987, 1990, 1993, Lowenberger & Rau 1994, Miller & Poulin 2001). Los caracoles estudiados conservan su comportamiento migratorio después de su castración o infección con las dos especies, por lo que la búsqueda de un hábitat adecuado para la transmisión de las cercarias podría estar forzada por éstas, siendo un proceso repetitivo y con el objetivo de completar el ciclo vital. Por lo tanto, este trabajo abre las puertas a futuros estudios sobre cambios de comportamiento provocados por parásitos como una adaptación para su transmisión. 8. Del bentos a las gaviotas: espectro de hospedadores y estrategias de de transmisión de Cardiocephaloides longicollis (Trematoda, Strigeidae) en el Mediterráneo 8.1. Introducción Los parásitos son elementos centrales de las cadenas tróficas acuáticas (Lafferty y col. 2006, 2008), ya que juegan un papel importante en la estructura de comunidades del hospedador y afectan a la estructura de la cadena trófica cuando infectan a un alto número de hospedadores (Thompson y col. 2005). Sin embargo, la información en este sentido es normalmente escasa (Poulin 2001). En parásitos con vitales complejos, el grado de especialización varía dependiendo del estado del parásito, por lo que se dan estrategias de transmisión específicas para cada especie y para cada estado del trematodo (Sukhdeo & Sukhdeo 2004, Poulin 2007). El trematodo digeneo Cardiocephaloides longicollis (Strigeidae) se encuentra en las costas europeas, y su ciclo vital se completa a través de las cadenas tróficas locales. Los adultos de C. longicollis se encuentran en el tracto digestivo del hospedador final (gaviotas), donde se reproducen sexualmente. Los huevos son liberados al agua a través de las heces, y cuando eclosionan sale un miracidio que infecta al primer hospedador intermediario, los caracoles Nassarius corniculum y N. reticulatus (Nassariidae). En ellos, se desarrollan esporocistos que contienen cercarias, que emergen del caracol para infectar a los peces. Las cercarias se mantienen en la columna de agua mediante fototactismo positivo para alcanzar a los segundos hospedadores intermediarios e infectarlos (Bartoli & Prévot 1986, Combes y col. 1994). Después, las cercarias migran a través de los tejidos del pez y se enquistan en los lóbulos ópticos del cerebro (Prévot & Bartoli 1980), manipulando su comportamiento al influir en su visión y habilidad natatoria (Prévot 1974, Barber & Crompton 1997). Este hecho facilita su transmisión, ya que los peces son más susceptibles a la depredación de las aves marinas (Poulin 2001, Moore 2002, Seppälä y col. 2004, Osset y col. 2005, Fredensborg & Longoria 2012), incrementando este comportamiento la acumulación de metacercarias en el cerebro (Barber & Crompton 1997, Fredensborg & Longoria 2012). Se han encontrado metacercarias en 7 familias de peces, infectando más frecuentemente a espáridos, blénidos, góbidos y lábridos (Prévot & Bartoli 1980, Bartoli & Prévot 1986, Machkevsky y col. 1990, Korniychuk 1997, Zander 2004, Osset y col. 2005).Osset y col. (2005) sugirió un posible impacto de los descartes en el ciclo vital de C. longicollis, pero no presentaron evidencias. El hecho de que las aves marinas se infecten con C. longicollis al consumir peces infectados (Bartoli & Prévot 1986, Fredensborg & Longoria 2012), en zonas con alta actividad pesquera, podría implicar que la transmisión de los parásitos podría verse aumentada si los descartes, sobre los que depredan las aves (Witt y col. 1981, Arcos y col. 2001, Christel y col. 2012) incluyeran a los individuos más parasitados. A pesar de las citas que existen sobre la aparición y frecuencia de C. longicollis, esta información no ha sido resumida con anterioridad, lo que no permite una comprensión holística de las dinámicas de transmisión de este parásito. Por lo tanto, queremos ampliar nuestro conocimiento sobre el ciclo vital de C. longicollis, analizando los hospedadores y estrategias de transmisión en todos los niveles, es decir, gasterópodos, peces y aves. Asimismo, se pretende determinar a qué microhábitat se dirigen las cercarias después de emerger del caracol, y determinar el efecto del pez sobre la acumulación de metacercarias, explorando también qué factores antropogénicos podrían aumentar la transmisión de C. longicollis. 8.2. Material y métodos Se llevó a cabo un muestreo oportunista de los hospedadores sospechosos de formar parte del ciclo vital de C. longicollis. Se recogieron 3351 moluscos (24 especies) en zonas someras del Mediterráneao, se obtuvieron 154 aves (17 especies) de dos centros de recuperación, uno cercano al Delta del Ebro y otro a Valencia; además, se recogieron 158 muestras fecales de la gaviota Larus michahellis de la Isla de Benidorm y se muestrearon 2108 peces (25 especies), incluyendo una muestra del teleósteo Sparus aurata de una instalación de acuicultura. Todas las muestras se examinaron para encontrar todos los estados de desarrollo de C. longicollis (huevos, esporocistos, cercarias, metacercarias y adultos), identificándolos morfológicamente con las descripciones de Prévot & Bartoli (1980) y Dubois (1968). Además, algunos especímenes se analizaron molecularmente con la metodología descrita en Born-Torrijos y col. (2012), excepto para la amplificación y secuenciación de la región ITS2 de ADNr, para la que se usaron los primers 3S e ITS2.2 (Morgan & Blair 1995, Cribb y col. 1998). Se calculó la prevalencia de infección, la intensidad media (rango), y la abundancia media (± desviación estándar) (Bush y col. 1997). Los datos incluidos de la literatura se obtuvieron después de una búsqueda en Web of Science (ThomsonReuters), completada con una búsqueda bibliográfica manual. Para los análisis estadísticos sólo se incluyeron “valores verdaderos negativos” de prevalencia, es decir, con la prevalencia cero pero existiendo citas previas en las que ese hospedador aparece infectado con C. longicollis. Se analizaron los datos mediante modelos generalizados lineales mixtos (GLMM) y modelos lineales mixtos (LMM) si el hábitat del pez (pelágico, demersal o bentónico) o la época de captura tenían un efecto sobre la prevalencia o abundancia de C. longicollis. Para acreditar la existencia de patrones congruentes del efecto del hábitat del pez sobre la prevalencia y abundancia de C. longicollis, se combinaron los datos de este estudio con los de la literatura, y se analizaron con modelos lineales (LM). La correlación entre la prevalencia e intensidad media se calculó con el coeficiente de correlación de Spearman, incluyendo todas las muestras de peces. Para investigar la relación entre la longitud del pez y la abundancia de C. longicollis, se usaron datos de 198 D. vulgaris y 196 D. annularis estratificados en clases de tamaño, y el efecto del número de metacercarias por pez se analizó con modelos lineales generalizados (GLM binomial negativo). Además, se calculó el grado de agregación con el índice de discrepancia (Poulin 1993) (Quantitative Parasitology, QP web, impulsado por R, versión 1.0.9) (Rozsa y col. 2000, Reiczigel y col. 2013). Los datos de aves se analizaron para comprobar la relación entre la prevalencia y la abundancia media de C. longicollis, incluyendo también datos de otros estudios. El efecto de la estacionalidad sobre el número de huevos de C. longicollis en las muestras fecales se analizó con un GLM binomial negativo. Todos los análisis se realizaron con diferentes paquetes de R (R Development Core Team, versión 3.0.1). 8.3. Resultados La prevalencia de C. longicollis en gasterópodos nasáridos es relativamente baja, con una prevalencia baja en comparación con otros niveles, añadiéndose sólo una nueva cita a nivel del primer hospedador intermediario (C. neritea), indicando así un grado de especificidad alto. A nivel de segundo hospedador intermediario, C. longicollis tiene un espectro de hospedadores mucho más amplio: se han añadido 12 nuevas citas de peces pertenecientes a las familias Sparidae, Labriidae, Gobiidae, Pomacentridae y Serranidae, siendo las dos últimas nuevas citas a nivel de familia. Además, se han encontrado metacercarias con una prevalencia de 53,9% en S. aurata de instalaciones de acuicultura. Las infecciones encontradas en tres especies de láridos, hospedadores finales, sobrepasan el 50% de prevalencia, siendo hasta 22 veces mayor que en citas anteriores. Todos los especímenes de C. longicollis se identificaron morfológicamente, confirmándose su identidad mediante métodos moleculares, encontrando un 100% de coincidencia con secuencias de la región 28S disponibles en GenBank (AY222171). Las secuencias de la región ITS de ADNr de huevos y adultos mostraron una coincidencia entre 99,7% y 100%, y se depositaron en Genbank. Los GLMM mostraron que la prevalencia general de C. longicollis es mayor en otoño e invierno, en comparación con primavera (P-valor<0,001), mientras que no mostró diferencias significativas entre hábitats (P-valor>0,05), posiblemente debido a los valores heterogéneos en los peces demersales y pelágicos y una única muestra bentónica. Sin embargo, la abundancia media mostraba niveles mayores en peces bentónicos en comparación con los demersales y pelágicos (LMM). Enfocándonos en el efecto del hábitat, sin tener en cuenta el efecto del pez, los peces demersales y bentónicos mostraron mayor prevalencia y abundancia media de C. longicollis en comparación con los pelágicos, sin diferencias entre ellos. Incluyendo datos de publicaciones previas, la abundancia media es 4 veces mayor en peces demersales, y 23 veces mayor en bentónicos que en pelágicos. Se observó una correlación positiva entre la prevalencia e intensidad media de C. longicollis en todas las muestras de peces. La prevalencia de C. longicollis mostró un aumento progresivo hasta 93-100%, en las dos clases de tamaño más altas de D. vulgaris. En estas clases, la intensidad y la abundancia disminuyeron con respecto a las clases de tamaños intermedios, donde estos valores eran máximos (120 a 148mm, 33-38 metacercarias/pez), y la agregación decreció notablemente. En D. annularis se observó un aumento de la intensidad y abundancia alcanzando los valores máximos en las dos clases de tamaño más altas (140 a 162 mm, 73 metacercarias/pez), a la vez que disminuyó también el nivel de agregación. Los GLM mostraron que el número de metacercarias en las dos especies de peces era mayor en las clases de tamaño más altas (P<0,01). Sólo se encontraron infecciones en láridos, mostrando L. michahellis, L. argentatus y L. andouinii valores mucho más altos que los encontrados previamente, con 66,7%, 69,2% y 50% respectivamente. No se encontró ninguna relación entre la prevalencia y la intensidad en las muestras de aves (incluyendo datos de la literatura). La prevalencia de huevos de C. longicollis en las muestras fecales fue mayor en primavera (42,9%), seguido de verano (35%), otoño (27,5%) e invierno (22,2%). Sin embargo, aunque las diferencias estacionales no resultaron significativas la mayor intensidad (número de huevos en una muestra) se dio en invierno (150,2 ± 534,0), seguido de primavera (71,9 ± 170,7). 8.4. Discusión Para saber el grado en que un parásito influye en el ecosistema y las redes tróficas, es esencial conocer el espectro completo de hospedadores y la abundancia del parásito en ellos. En este estudio, se han investigado qué hospedadores forman parte del ciclo vital de C. longicollis, demostrando que afecta a un amplio espectro de segundos hospedadores intermediarios. Además, las tasas de infección en hospedadores definitivos es mayor que las descritas con anterioridad, por lo que se quiere estudiar qué factores podrían ser responsables del aumento detectado en la prevalencia de C. longicollis, y por lo tanto de su transmisión. Debido a la longevidad de las metacercarias dentro del hospedador (incluso años, Chubb 1979), no se esperaba observar estacionalidad en la prevalencia, siendo consumidas por las gaviotas durante todo el año. Éstas, al ser organismos homeotérmicos, permiten el desarrollo continuo de los adultos, como demuestra la falta de cambios estacionales en la prevalencia de huevos en las muestras fecales de L. michahellis. La detección de una abundancia de metacercarias mayor en invierno y otoño se puede deber tanto a un aumento de las infecciones de peces después del verano, cuando la producción de cercarias aumenta con las temperaturas altas (ver Poulin 2006), como a una mayor depredación de peces en primavera por parte de las gaviotas (Annett & Pierotti 1989), eliminando así a los peces más infectados y provocando una disminución de las tasas de infección. El comportamiento de las cercarias determina el nicho ecológico donde los peces van a ser infectados, guiándose por la luz para elegir el microhábitat (Bartoli & Prévot 1986, Combes y col. 1994, Smith & Cohen 2012). Hasta lo que conocemos, esta es la primera vez que se han comparado niveles de infección de C. longicollis entre peces de diferentes hábitats, concluyendo que la abundancia media en peces demersales y bentónicos es entre 4 y 23 veces mayor que en pelágicos, aunque probablemente los peces bentónicos actúen de sumideros al no ser consumidos por las aves. El comportamiento de natación dirigido de las cercarias incrementa la exposición de los peces demersales, por lo que éstos de manera general, mostraron los mayores valores de infección, con hasta 100% de prevalencia de infección. El efecto acumulativo de parásitos con el tamaño del pez se ha estudiado en varias especies (Thomas y col. 1995, Rousset y col. 1996, Osset y col. 2005), caracterizado por un descenso de la agregación de los parásitos que podría indicar que los individuos altamente infectaos son eliminados de la población (mortalidad inducida por los parásitos) (Anderson & Gordon 1982, Rousset y col. 1996, Poulin 2001). Esto se observó en los peces D. annularis y D. vulgaris. La interferencia de estos parásitos en la visión y natación de los peces modifica su comportamiento y aumenta su permanencia en la superficie del agua (Osset y col. 2005, Bartoli & Boudouresque 2007), lo que explicaría la eliminación de los individuos más infectados. La variación en la abundancia de los parásitos en las gaviotas podría ser una consecuencia de los hábitos alimenticios de cada especie (Roca y col. 1999). Por ejemplo, L. michahellis se alimenta sobre peces mayores que L. audouinii (Witt y col. 1981), mientras que aves más pequeñas (Chroicocephalus ridibundus o charranes, familia Sternidae) lo hacen sobre presas pequeñas (Oro & Ruiz 1997), por lo que la carga parasitaria que les llega es diferente según el tamaño del pez. Cabe destacar que el tamaño de presa sobre el que depredan L. audouinii, y sobretodo L. michahellis, coincide con el de los peces con mayores niveles de infección, por lo que eliminan de la población a los peces con mayor número de metacercarias, maximizando así también el número de parásitos en el hospedador final. Larus audouinii y L. michahellis tienen una plasticidad comportamental grande dependiendo de la disponibilidad de alimento, alimentándose así de peces demersales y bentónicos de los descartes de las pesquerías (Arcos y col. 2001, Christel y col. 2012). Las altas prevalencias de C. longicollis en gaviotas demuestran la ingesta incrementada de hospedadores intermediarios con tasas de infección altas, es decir, peces demersales. Por lo tanto, existe una transmisión favorecida por las actividades pesqueras, que son intensas en las áreas donde se han obtenido las gaviotas; en el Delta del Ebro los descartes se estiman alrededor de un 41% de la pesca (Oro & Ruiz 1997, Coll y col. 2008), y mantiene poblaciones grandes de L. audouinii, L. cachinnans, L. michahellis y C. ridibundus (Oro & Ruiz 1997, Arcos y col. 2001). Además, muchas de las especies de peces hospedadoras de C. longicollis son también frecuentemente descartadas (Sánchez y col. 2004, Tzanatos y col. 2007), y su tamaño coincide con el tamaño de presa de las gaviotas (Oro & Ruiz 1997, Machias y col. 2004). Asimismo, la prevalencia de C. longicollis en el gasterópodo N. reticulatus (8,3%) en la laguna del Ebro es mayor que las citadas anteriormente, por lo que la transmisión del parásito a través de las heces de las aves que depredan sobre las explotaciones pesqueras adyacentes es exitosa. Los niveles de infección encontrados en peces (40–100%) y gaviotas (27–69%) de áreas lagunares señalan estos hábitats confinados como los más favorables para C. longicollis, ya que concentran a los hospedadores intermediarios y finales, facilitando la transmisión del parásito. Además, las instalaciones de acuicultura podrían actuar como potenciadores de la transmisión de C. longicollis por la cercanía de los hospedadores al atraer moluscos y aves piscívoras (Edgar y col. 2005). De hecho, en este estudio aportamos, por primera vez, datos sobre metacercarias de C. longicollis en S. aurata cultivada, con una prevalencia de 53,9%., por lo que se espera un impacto aun mayor sobre la transmisión de C. longicollis. Dado el alto número de especies afectadas por C. longicollis, este parásito podría tener un efecto fuerte en el flujo energético de la cadena trófica, incluso en condiciones naturales. Sin embargo, la transmisión potenciada por gaviotas por causas antropogénicas (actividades pesqueras y descartes), hace que C. longicollis sea un candidato ideal para comparar estructuras de la cadena trófica en áreas naturales con aquellas áreas con un alto impacto pesquero. 9. Conclusiones Como resultado de este estudio se obtuvieron las siguientes conclusiones: 1. Las cercarias y metacercarias que infectan a los gasterópodos G. adansonii y C. neritea, comunes en las lagunas mediterráneas, han sido descritas y comparadas con las citadas en la bibliografía, siendo identificadas como los estados larvales de Cainocreadium labracis (Dujardin, 1845) y Macvicaria obovata (Molin, 1859), ambos pertenecientes a la familia Opecoelidae. Las dos cercarias se encontraron con altas prevalencias (22.04% y 23,1%, respectivamente) en G. adansonii. También se encontraron metacercarias de M. obovata en C. neritea (alcanzando 100% de prevalencia), indicando una transmisión exitosa y la compleción del ciclo vital de estas especies en lagunas del Mediterráneo. 2. Las cercarias de C. labracis y M. obovata son de tipo cotilocerco y morfológicamente muy similares, sin embargo las secuencias ITS de ADNr las atribuyó a dos especies de trematodos diferentes, cuyas secuencias de ADN están publicadas y disponibles en GenBank. De este modo, el hallazgo de la cercaria de M. obovata ayudó a dilucidar un nuevo ciclo vital de trematodo, ya que tanto los estados larvales como el segundo hospedador intermediario eran hasta ahora desconocidos. 3. Debido al problema de comparar descripciones morfológicas de estados del ciclo vital de trematodos elaboradas por diferentes autores, frecuentemente realizadas con diferentes métodos de fijación, tinción etc., es importante subrayar la necesidad de basar la caracterización y/o identificación completa de tales estados del ciclo vital en una combinación de tanto su descripción morfológica como de la secuenciación del ADN. Esto es especialmente importante en el caso de estados morfológicamente similares, tales como las cercarias de M. obovata y C. labracis. 4. El enfoque experimental ha permitido describir los factores abióticos que tienen un impacto sobre la emergencia de las cercarias de C. labracis y M. obovata desde el caracol G. adansonii. Los digeneos, y en particular los estados de vida libre como las cercarias, se encuentran entre los parásitos más expuestos a las variaciones ambientales naturales; sin embargo, existe una ausencia de información sobre la adaptación de las estrategias de transmisión de los trematodos a las variaciones ambientales extremas que se dan en las lagunas. Por lo tanto, este estudio amplía nuestro conocimiento sobre los ritmos específicos de emergencia de digeneos presentes en este hábitat, y, más específicamente, en relación a cercarias con una capacidad de dispersión limitada. 5. Los patrones de emergencia larval de estas dos especies, que comparten el mismo hábitat, el mismo primer hospedador intermediario y la misma estrategia de búsqueda de segundo hospedador, contrastan entre sí, por lo que se demuestran la complejidad de los mecanismos de control exógeno y endógeno que están dirigidos a maximizar el encuentro con los hospedadores específicos. El aumento de la temperatura, el nivel de agua bajo y la oscuridad parecen desencadenar la emergencia de M. obovata de modo que las cercarias infecten al molusco nocturno C. neritea. Esto ocurre probablemente al bajar el nivel del agua y formarse pequeños charcos que concentran a las cercarias en un volumen de agua pequeño. Por el contrario, el aumento de la emergencia durante el día y principios de verano (fotoperiodo de 12 h luz: 12 h oscuridad) permite a C. labracis coincidir con pequeños peces bentónicos, como los góbidos, en zonas poco profundas con alta salinidad. 6. La correcta estimación de la prevalencia de infecciones larvales de trematodo es esencial para entender la estructura de la comunidad parasitaria y la dinámica de las infecciones múltiples. El diseño y la aplicación de una PCR dúplex para dos sistemas parásito-hospedador con infecciones dobles demostraron la mayor precisión de los métodos moleculares para la detección de caracoles infectados en comparación con el método clásico de observación de la emergencia de cercarias. Hasta donde llega nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se comparan las prevalencias de infección obtenidas mediante ambas técnicas. La PCR dúplex detectó entre 0,6% y 54,2% más infecciones simples y entre 2,4% y 9,5% más infecciones dobles que la emergencia de cercarias, evidenciando así la presencia de infecciones inmaduras que no se detectan por el método clásico. 7. El diseño de la PCR dúplex ayuda, además, a la identificación de especies morfológicamente similares que co-infectan al mismo individuo, tales como M. obovata y C. labracis, así como a la resolución de infecciones inmaduras. Esto es de particular importancia en las infecciones dobles, donde la competencia interespecífica puede afectar al desarrollo de las cercarias y su liberación al medio. La prevalencia detectada por PCR dúplex sugiere que las infecciones dobles son más frecuentes de lo esperado, lo que podría apuntar a una menor competencia dentro del hospedador. Sin embargo, las posibles infecciones nuevas de una especie pueden ser eliminadas por otras especies competitivas previamente establecidas, coexistiendo por lo tanto ambas especies sólo brevemente; en este caso la PCR dúplex podría sobrestimar la frecuencia de las infecciones dobles completamente establecidas, que conducen a la emergencia de cercarias y su transmisión, por lo que estos resultados deben ser interpretados con precaución. 8. Los resultados de esta tesis evidencian la necesidad de revisar conclusiones anteriores basadas en la emergencia de cercarias en relación a la competencia interespecífica, los parámetros poblacionales de los parásitos y las fluctuaciones estacionales de infecciones en hospedadores gasterópodos. Sin embargo, aunque en general proporciona una descripción más exacta de las tasas de infección, el análisis específico de la PCR dúplex no tiene en cuenta la madurez de las infecciones. Por lo tanto, debe ser considerado como una herramienta adicional en una aproximación combinada, tanto de la observación de la emergencia de cercarias como de análisis moleculares, que en conjunto determinarían con la máxima precisión las prevalencias y niveles de madurez de las larvas de trematodos en caracoles. 9. Las peculiaridades ecológicas, fisiológicas y biológicas del sistema parásito-hospedador C. labracis/M. obovata-G adansonii se examinaron más en detalle, determinando los patrones de desarrollo dentro de los esporocistos, localizados en las gónadas y la glándula digestiva del caracol. Gibbula adansonii se encuentra en el hábitat intermareal de la laguna del Delta del Ebro sólo de marzo a mayo, debido a la migración hacia estratos superiores relacionada con el desove y asociada a la permanencia en este hábitat intermareal lagunar con fines reproductivos. Debido a la poca movilidad de ambas cercarias, necesitan emerger del caracol en una zona próxima a sus siguientes hospedadores intermediarios. Se encontraron cercarias maduras emergiendo de manera continuada y en gran número durante los meses de primavera, mostrando una madurez de los esporocistos máxima en abril, garantizando así la compleción de ambos ciclos vitales, ya que los segundos hospedadores intermediarios de las dos especies están presentes en el hábitat intermareal durante ese momento. 10. Podría existir un vínculo entre la maduración de las larvas y la residencia del caracol en la parte más superficial del hábitat intermareal, ya que existe una sincronización espacial y temporal de la maduración del parásito y del hospedador. Además, la manipulación del comportamiento del hospedador para aumentar las probabilidades de transmisión de las larvas a los siguientes hospedadores es una adaptación extendida en los trematodos; los caracoles parasitados modifican así su distribución vertical facilitando la transmisión de las cercarias. La posible explotación de la migración relacionada con la reproducción de los caracoles por parte de las dos especies de cercaria abre por lo tanto una puerta a futuros estudios sobre los cambios de comportamiento inducidos por parásitos como una adaptación verdadera para su transmisión. 11. El estudio a gran escala sobre el espectro de hospedadores y los niveles de infección de C. longicollis durante su ciclo vital, resultó en nuevas citas de primer, y especialmente, segundo hospedador intermediario, con 2 taxones de gasterópodos, 31 taxones de peces y 15 taxones de aves citados como hospedadores hasta la fecha (incluyendo los resultados actuales). Cardiocephaloides longicollis muestra una baja especificidad respecto a los hospedadores, especialmente en el segundo hospedador intermediario. Es la primera vez que se comparan niveles de infección de C. longicollis en peces de diferentes hábitats. Las tasas de infección más altas se encuentran en los peces demersales, en comparación con los peces pelágicos y bentónicos, lo que confirma que este hábitat es al que se dirigen las cercarias después de su emergencia desde el caracol. 12. La acumulación en el tiempo de metacercarias de C. longicollis en el cerebro de los peces se demostró en dos especies de peces espáridos. Los niveles crecientes de parásitos inducen comportamientos que hacen que los peces infectados sean más susceptibles a la depredación por el hospedador definitivo, favoreciendo así su transmisión a las gaviotas. Además, la disminución de la agregación del parásito en las clases de tamaño más grandes de peces indica una ‘mortalidad inducida por parásitos’, por la cual los peces más infectados son eliminados de la población. 13. La prevalencia de C. longicollis en caracoles y aves hospedadoras de las zonas mediterráneas, donde las actividades de pesca extractiva son comunes, fue mayor que la obtenida en cualquier estudio previo. La captura accidental y los descartes atraen carroñeros como las gaviotas, que se alimentan de peces demersales y bentónicos descartados, que de otro modo serían menos accesibles para ellos. Por lo tanto, las altas tasas de infección encontradas en las gaviotas pueden explicarse por el consumo de los descartes de peces demersales, que tienen las cargas parasitarias más altas. Esto sugiere una transmisión de C. longicollis facilitada por factores antropogénicos. Además, y por primera vez, se han encontrado metacercarias de C. longicollis en un pez de instalaciones de acuicultura, es decir, en Sparus aurata con una prevalencia de infección de alrededor del 54%. Por lo tanto, aunque todavía es difícil de estimar, las actividades acuícolas pueden aumentar aún más el impacto sobre el ciclo vital de C. longicollis aumentando su transmisión. 14. Al ser una especie generalista transmitida tróficamente con un ciclo vital complejo que afecta a un elevado número de especies hospedadoras, C. longicollis puede tener un gran efecto sobre el flujo de energía a través de la cadena alimenticia, incluso en condiciones naturales, siendo por lo tanto un candidato ideal para comparar futuras estructuras de la cadena trófica en comunidades naturales con aquellas afectadas por la pesquería.