Evolution and comparative genomics of di-symbiotic systems in aphids from the Lachninae subfamily and genome reduction in Serratia symbiotica

Introducción El término "simbiosis" (del griego σύν ’juntos’ y βίωσις ’vivir’), en su contexto biológico, fue acuñado por Heinrich Anton de Bary en su obra titulado "Erscheinung der Symbiose". El definió "simbiosis" como "la vida en conjunción de dos organismos disímiles", sin restringirlo a los efectos de la interacción sobre los miemros de ésta. Aunque el término se ha utilizado de manera más restrictiva, la definición de de Bary mantiene como la más inclusiva, teniendo en cuenta todo el espectro desde neutral, a las asociaciones perjudiciales. Dentro de este espectro, se han reconocido 6 grandes categorías de interacciones simbióticas, basadas en las posibles combinaciones de efectos neutrales (0), beneficiosos (+) y perjudiciales (-). El presente trabajo nos centraremos principalmente en un tipo de interacción: el mutualismo (+/+). el término mutualismo está reservado para las relaciones simbióticas donde cada miembro se beneficia de la actividad del otro. Al socio de mayor tamaño se le conce como el hospedero, mientras que el término simbionte se reserva comúnmente para el siocio de menor tamaño. Las relaciones simbióticas están presentes en diversos organismos a lo largo del árbol evolutivo. Este tipo de relaciones han jugado un papel importante, por ejemplo, en el desarrollo de la célula eucariota. En 1967, la bióloga Lynn Margulis sintetizó la teoría endosimbiótica, en la cual integraba y exponía el conocimiento actual acerca de los organelos celulares y proponía que éstos se habían originado a partir de una simbiosis inicial de la célula protoeucariota con una bacteria aeróbica, en el caso de la mitocondria, y una Cyanobacteria, en el caso del cloroplasto, lo cuál se comprobó a través de análisis filogenéticos. Como muchos animales, una importante cantidad de insectos mantiene asociaciones simbióticas obligadas con bacterias endosimbiontes. Éstas generalmente viven dentro de bacteriocitos (células especializadas en albergarlas), los cuales forman un órgano llamado el bacterioma. Una característica común de estos organismos endosimbióticos es la de tener un genoma reducido, lo cuál deriva de varios factores: i) Su modo vertical de transmisión, en el cual sólo una pequeña cantidad de éstos será heredado en la siguiente generación lo que acentúa el efecto de la deriva genética y el trinquete de Muller asociado; ii) La pérdida de genes de recombinación y reparación de ADN; iii) La relajación de la selección sobre genes redundantes e innecesarios para su nuevo estilo de vida. Durante este proceso de reducción genómica, los genomas endosimbióticos sufren una serie de cambios drásticos en contenido genético y arquitectura genómica. En los primeros estadíos, los genomas se encuentran altamente enriquecidos en pseudogenes y elementos móviles (EMs), principalmente elementos de inserción (ISs). En estadíos avanzados de esta reducción genómica, existe una pérdida total de la redundancia genética y de los EMs, acompañada de una pérdida casi total de los pseudogenes. En los casos más extremos, la pérdida de genes en tan drástica que se cuestiona su identidad como organismo celular. Los áfidos (Hemiptera: Aphididae) mantienen una relación simbiótica obligada con bacterias endosimbiontes del género Buchnera (denominada endosimbionte primario), que habita en el citoplasma de bacteriocitos y está contenida dentro de una membrana simbiosomal (derivada de la membrana del hospedero). Buchnera provee al áfido de aminoácidos esenciales (EAAs), los cuáles son carentes en su estricta dieta basada en floema de planta. Además de Buchnera, los áfidos pueden contener endosimbiontes secundarios, los cuales pueden ser obligados o facultativos. Los endosimbiontes facultativos, al contrario de los obligados, no son necesarios para el correcto desarrollo supervivencia del hospedero, sin embargo, pueden dotarlo de características ventajosas bajo ciertos estreses ambientales. Por ejemplo, el endosimbionte Serratia symbiotica aumenta la tasa de supervivencia de áfidos de la especie Acyrthosiphon pisum después de sufrir un golpe de calor. Dentro de la subfamilia Lachninae de áfidos, se han encontrado endosimbiontes secundarios en todos los miembros que han sido analizados por medio de microscopía. Para la mayoría de las especies, este endosimbionte secundario pertenece a la especie S. symbiotica. El análisis genómico del endosimbionte Buchnera en dos especies de Cinara (C. (Ci.) cedri y C. (Cu.) tujafilina) pertenecientes a la subfamilia Lachninae (BCc y BCt, respectivamente), ha revelado que existe una pérdida común de los genes involucrados en la biosíntesis de riboflavina (vitamina B 2 ), la cual es esencial para el correcto desarrollo del hospedero. La secuenciación del endosimbionte secundario S. symbiotica de C. (Ci.) cedri (SCc), reveló que éste era requerido para la biosíntesis, en colaboración con Buchnera, de varios compuestos esenciales para el áfido, además de que retenía los genes necesarios para sintetizar riboflavina, subsanando así la pérdida de esta capacidad biosintética en Buchnera. Por ello se considera un endosimbionte obligado, junto con Buchnera. Asimismo, SCc presentaba un genoma mucho más reducido que el de la cepa facultativa de S. symbiotica de Ac. pisum (SAp), sin embargo, al contrario de otros endosimbiontes altamente reducidos, como Buchnera, mantenía una gran cantidad de genoma "basura" y pseudogenes. Por lo tanto, SAp y SCc representan dos estadíos distintos del proceso de reducción genómica. Objetivos Esta tesis trata de entender el proceso de adquisición de S. symbiotica en diversos miembros de la subfamilia Lachninae de áfidos, así como el proceso de reducción genómica sufrido por S. symbiotica. También, se explora la diversidad de endosimbiontes secundarios en Lachninae y se trata de reconstruír la historia evolutiva de estas asociaciones. Para esto se han definido cuatro objetivos principales: 1. Explorar los cambios genómicos que se producen en las primeras etapas del proceso de acomodamiento, sufrido por un endosimbionte coobligado, al nuevo sistema endosimbiótico. Esto se abordó a través de la secuenciación y ensamblaje del genoma de S. symbiotica de C. (Cu.) tujafilina (SCt). Elegimos este organismo dado las diferencias histológicas observadas cuando se compara con SCc, las cuáles muestran a SCt más cercana a la facultativa SAp. 2. Contrastar la hipótesis de una adquisición ancestral de S. symbiotica como endosimbionte coobligado en los miembros de Lachninae (seguida de divergencia), frente a la sustitución de S. symbiotica en la rama que conduce al subgénero Cinara (Cupressobium). Esto se abordó a través de la comparación de los sistemas endosimbiótico coobligados de C. (Ci.) cedri (BCc y SCc) y Tuberolachnus salignus (BTs y STs), cuyas cepas de S. symbiotica pertenecen al mismo clado filogenético con características similares a endosimbiontes obligados. 3. Entender el establecimiento y posteriores putativos reemplazos de S. symbiotica dentro de la subfamilia Lachninae. Esto fue abordado a través de la caracterización molecular y análisis microscópico de endosimbiontes secundarios de especies representativas de diferentes clados de Lachninae. 4. Diseccionar el proceso de reducción del genoma de S. symbiotica y contrastar los resultados con otros endosimbiontes de genoma reducido, evaluando de esta manera la generalidad de las observaciones en S. symbiotica. Esto se abordó a través de la comparación de Serratia marcescens Db11, cepa de vida libre, contra las diferentes cepas de S. symbiotica aisladas de diferentes áfidos de las subfamilias Aphidinae y Lachninae. Metodología y Resultados Capítulo 1. El genoma de Serratia symbiotica, endosymbionte coobligado "reciente" del áfido Cinara (Cupressobium) tujafilina Son particularmente interesantes los casos de endosimbiosis mutualista en la cual interviene más de un simbionte. Durante el proceso de adaptación que sufre una bacteria de vida libre en su camino a convertirse en un endosimbionte intracellular obligado, el simbionte experimenta pérdidas genómicas importantes y ajustes fenotípicos. A partir de las observaciones microscópicas y filogenéticas realizadas con anterioridad, se propuso que el endosimbionte secundario S. symbiotica de C. (Cu.) tujafilina podría haberse adaptado recientemente al sistema áfido-Buchnera, debido a su cercanía molecular e histológica a SAp. Por medio de una combinación de técnicas de secuenciación masiva (454 FLX titanium e Illumina HiSeq2000), hemos secuenciado y ensamblado el genoma de S. symbiotica de C. (Cu.) tujafilina, el cuál se esperaba se encontrara en un estadío muy temprano de adaptación como endosimbionte coobligado junto con el consorcio áfido-Buchnera. A continuación, se escrutaron los cambios en la coevolución de SCt y BCt, prestando especial atención a las transformaciones experimentadas por SCt, en comparación con SAp, para convertirse en un simbionte obligado. A pesar de que SCt está filogenética y genómicamente muy estrechamente relacionado con el endosimbionte facultativo SAp, muestra una variedad de alteraciones metabólicas, genéticas y de arquitectura genómica, que sugieren que este endosimbionte está un paso más cerca de convertirse en un endosimbionte intracelular coobligado que SAp. Utilizando técnicas de genómica comparativa, hemos descrito en profundidad el proceso de reorganización genómica sufrido por SCt y SAp, así como el papel que han jugado los MEs en éste. Mediante la reconstrucción metabólica de SCt, hemos determinado que la pérdida de la capacidad biosintética de la riboflavina en BCt, postula a SCt como el provisor de este compuesto esencial. Finalmente, postulamos que la pérdida de la capacidad biosintética en la producción de riboflavina en Buchnera, ha sido la clave para la el establecimiento de S. symbiotica como endosimbionte coobligado en los áfidos que pertenecientes a la subfamilia Lachninane Capítulo 2. Convergencia evolutiva entre los sistemas endosimbióticos coobligados de los áfidos Tuberolachnus salignus y Cinara (Cinara) cedri Como mencionado anteriormente, muchas especies de la subfamilia Lachninae parecen estar asociadas consistentemente con el endosimbionte secundario S. symbiotica. Hemos demostrado anteriormente que tanto C. (Ci.) cedri y C. (Cu.) tujafilina (Lachninae de la tribu Eulachnini) han establecido asociaciones de carácter coobligado tanto con Buchnera como con S. symbiotica. Sin embargo, mientras que los genomas de Buchnera de ambas especies de Cinara son genómica y funcionalmente muy similares, existe una degradación diferencial importante entre los genomas de sus correspondientes cepas de S. symbiotica. Para entender mejor la esencialidad y el grado de integración de S. symbiotica dentro de Lachninae, hemos secuenciado el genoma de ambos endosimbiontes, Buchnera y S. symbiotica del áfido Tu. salignus (Lachninae de la tribu Tuberolachnini) mediante técnicas de secuenciación masiva (Illumina HiSeq2000). A través de la genómica comparativa, hemos encontrado un sorprendente nivel de similitud entre el sistema endosimbiótico de este áfido y el de C. (Ci.) cedri. En ambos hospederos, S. symbiotica ha evolucionado un genoma muy reducido y, a través de microscopía de hibridación fluorescente in situ (FISH), hemos determinado que en ambas especies de áfidos el endosimbionte secundario se encuentra exclusivamente en el interior del citoplasma de bacteriocitos. Mediante la reconstrucción metabólica, hemos encontrado que, curiosamente, los endosimbiontes de Tu. salignus presentan la misma complementación metabólica observada en C. (Ci.) cedri para la producción de triptófano, la cual no se observa en el sistema endosimbiótico coobligado de C. (Cu.) tujafilina. Por otra parte, hemos corroborado que en cuanto a la biosíntesis de riboflavina, BTs, al igual que BCc y BCt, ha perdido la capacidad de sintetizar esta vitamina y STs ahora realiza esta función, de este modo, proporcionando más apoyo a la hipótesis del establecimiento de un endosimbionte coobligado en el ancestro común de los áfidos de la subfamilia Lachninae (LLCA). Por último, hemos propuesto que la putativa división convergente de la biosíntesis de triptófano entre Buchnera y S. symbiotica, podría estar detrás de la internalización obligada de S. symbiotica al citoplasma de bacteriocitos propios y el desencadenamiento de una mayor degradación genómica. Capítulo 3. Identidad y localización de endosimbiontes secundarios de la subfamilia Lachninae de áfidos Como ya se ha indicado, la mayoría de los áfidos de la subfamilia Lachninae se han encontrado consistentemente albergando endosimbiontes secundarios, principalmente S. symbiotica. Esta aparente dependencia de endosimbiontes secundarios parece haber sido provocada por la pérdida de la capacidad de biosíntesis de riboflavina por Buchnera en el LLCA. Sin embargo, ningún análisis integral a gran escala de endosimbiontes secundarios en los Lachninae se ha realizado hasta la fecha, lo que dificulta la interpretación de los análisis evolutivos y genómicas de estos endosimbiontes. Por esta razón, hemos analizado los endosimbiontes de diferentes especies lejanas pertenecientes a siete diferentes géneros de Lachninae, que abarcan cuatro tribus, tanto por FISH (exploración de la morfología de los simbiontes y el tropismo celular) y la secuenciación del gen del 16S rRNA. Hemos corroborado que todos los áfidos analizados poseen sistemas endosimbióticos duales, y aunque la mayoría alberga S. symbiotica, algunos han sufrido reemplazamiento del simbionte secundario por otros taxones bacterianos filogenéticamente distintos. Hemos determinamos que estos endosimbiontes secundarios muestran formas de células y el tropismo celulares contrastantes, y algunos parecen ser dependientes de linaje. Ello nos ha permitido proponer un escenario evolutivo para el establecimiento de un endosimbionte secundario ancestral en los Lachninae, seguido de internalizaciones independientes a bacteriocitos así como de reemplazamientos. Capítulo 4. Reducción genómica en Serratia symbiotica La reducción genómica es un fenómeno generalizado entre los organismos endosimbióticos heredados verticalmente, desde los intracelulares asociados a bacteriocitos hasta los extracelulares asociados al intestino. Esta erosión genómica es un proceso gradual en el cual los organismos de vida libre evolucionan para convertirse en endosimbiontes obligados, perdiendo genes y/o funciones no esenciales o redundantes. S. symbiotica, muestra varias características que lo hacen un excelente organismo modelo para el estudio de la reducción genómica. Mientras que algunas cepas son de carácter facultativo para el hospedero, otras han establecido asociaciones coobligado con sus respectivas especies de áfidos y su correspondiente endosimbionte primario (Buchnera). Además, las diferentes cepas tienen genomas de tamaños y características muy contrastantes, y además presentan un tropismo celular, formas y tamaños celulares sorprendentemente dispares. Por último, genomas pertenecientes a S. marcescens, bacterias de vida libre estrechamente relacionadas a S. symbiotica, también están disponibles para realizar análisis de genómica comparativa. A través de la reanotación genómica de genes involucrados en procesos de información (replicación y reparación de ADN, ribosoma, modificación de ribosomas y tRNAs) y de genes de RNA, hemos diseccionado el proceso de reducción genómica en S. symbiotica. Asimismo, la anotación de estos mismos genes en otros organismos de genoma reducido ha corroborado que los patrones de reducción observados en S. symbiotica son compartidos con otros genomas menguantes. Esto demuestra que S. symbiotica es un buen modelo para el estudio del proceso de reducción genómica de un solo taxón bacteriano (S. symbiotica) que evoluciona en un nicho biológico similar (áfido-Buchnera). Conclusiones Generales Una cuestión clave en la biología evolutiva es la de cómo las asociaciones mutualista evolucionan. Una forma de abordar este problema es investigar las asociaciones mutualistas de reciente creación, en particular mediante la comparación de diferentes sistemas simbióticos en huéspedes estrechamente relacionados. En el presente trabajo hemos analizado tanto molecular como microscópicamente los sistemas endosimbióticos de varias especies de la subfamilia Lachninae. Primero, hemos corroborado que la presencia de endosimbiontes secundarios en los Lachninae es aparentemente universal, ya que todos los miembros analizados por microscopía tanto en este trabajo como en previos estudios han revelado que contienen endosimbiontes adicionales a Buchnera. A pesar de que la mayoría de estos endosimbiontes pertenecen a la especie S. symbiotica, algunos linajes han sufrido reemplazamientos genómicos por bacterias pertenecientes a diferentes taxones. Asimismo, incluso dentro de las S. symbiotica, existe una gran variedad en tipo de relación, morfología celular y localización dentro del bacterioma. La presencia de S. symbiotica en especies de Lachninae pertenecientes a diferentes tribus lejanamente relacionadas, nos lleva a proponer una infección ancestral por S. symbiotica en el LLCA, la cual fue fijada por la pseudogenización de los genes implicados en la biosíntesis de riboflavina, seguida de divergencia y reemplazamiento de simbionte. Segundo, la secuenciación del genoma de SCt y su comparación contra la cepa facultativa SAp, ha revelado la transición de S. symbiotica de endosimbionte facultativo a obligado, desencadenada no por un cambio en S. symbiotica, sino por una pérdida en la capacidad biosintética de Buchnera para producir la riboflavina, una coenzyma esencial. Mediante la comparación minuciosa de los genomas de SCt y SAp, hemos encontrado varias pseudogenizaciones de genes relacionados a la síntesis de EAAs en SCt, lo cuál refuerza la hipótesis de que este endosimbionte ya ha comenzado el proceso de adaptación al sistema endosimbiótico del áfido y Buchnera en C. (Cu.) tujafilina. Tercero, el análisis genómico y microscópico del sistema endosimbiótico de Tu. salignus reveló un gran nivel de convergencia evolutiva entre este sistema y el de C. (Ci.) cedri. Hemos encontrado que SCc y STs han sufrido eventos independientes de reducción genómica, y putativamente del establecimiento de complementación metabólica para la síntesis del triptófano y la biotina. Cuarto, mediante la comparación genómica de las diferentes cepas de S. symbiotica, hemos diseccionado los distintos estadíos de reducción genómica en los que se encuentran las distintas cepas de S. symbiotica. Las pérdidas génicas, la erosión genómica y la reducción de genes y maquinaria informacional, son compartidas por otras bacterias endosimbióticas reducidas, lo cual apunta a la generalidad de estas observaciones y valida a S. symbiotica como un buen modelo para el estudio de la reducción genómica en endosimbiontes. Finalmente, este trabajo ha revelado la naturaleza dinámica de las relaciones establecidas "recientemente" en áfidos de la subfamilia Lachninae, y ha revelado procesos claves de la transición de un organismo de vida libre a uno endosimbiótico.