Dirofilaria immitis and Angiostrongylus vasorum : epidemiology and impact of major heartworms in carnivores in Portugal

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Especialidade de Sanidade Animal

Cardiopulmonary nematodes, Dirofilaria immitis and Angiostrongylus vasorum, are severe and life-threatening parasites that are increasingly reported throughout Europe. However, in Portugal, accurate data on both illnesses is scarce, hampering the awareness and the implementation of effective prevention and control strategies. A multidisciplinary study was therefore designed to characterize and assess the current situation regarding dirofilariosis and angiostrongylosis in carnivores from Portugal. A national survey was conducted to assess the prevalence and distribution of D. immitis and A. vasorum in canine and red fox populations in Portugal, confirming the occurrence of both diseases in canids either from northern, central and southern regions. An overall prevalence of 11.9% and 0.7% dogs, and 8.5% and 12.7% foxes were positive to D. immitis and A. vasorum, respectively. Additionally, a high prevalence of D. immitis was found in pinnipeds kept at an oceanographic park in the Algarve region where the South African fur seal was also reported as a new host for D. immitis infection. DNA of the endosymbiont bacterium Wolbachia pipientis was detected in dogs naturally infected with D. immitis in Portugal. The transmission risk period for Dirofilaria spp. in Portugal was estimated, showing that although transmission is markedly seasonal, the necessary climatic factors are starting earlier and lasting longer than the summer. A new minimally invasive surgical technique was developed to extract D. immitis adult worms from the hearts of dogs through transjugular catheterization with a non-traumatic snare. A questionnaire conducted on Portuguese pet owners showed that the majority deworm their dogs at irregular and consequently ineffective intervals and their level of knowledge about parasites and parasitic diseases is low. Although exposure may differ depending on the region of Portugal, the likelihood of cardiopulmonary dirofilariosis and angiostrongylosis is considerable nationwide. Active surveillance, increasing awareness and regular preventive measures are crucial to control cardiopulmonary parasitic diseases in carnivores in the country.

RESUMO - Dirofilaria immitis e Angiostrongylus vasorum: epidemiologia e impacto dos principais nemátodes cardiopulmonares em carnívoros em Portugal - A dirofilariose e a angiostrongilose são doenças parasitárias crescentemente notificadas em toda a Europa, representando uma ameaça grave para a saúde animal. São causadas respetivamente pelos nemátodes cardiopulmonares Dirofilaria immitis (agente transmitido por mosquitos culicídeos) e Angiostrongylus vasorum (agente transmitido por moluscos gastrópodes). Os fatores subjacentes a esta expansão são diversos, destacando-se a globalização, as alterações climáticas, a conjuntura socioeconómica, espécies invasoras com capacidade vetorial, urbanização de hospedeiros silvestres, bem como novos métodos de diagnóstico. Dados concretos sobre a prevalência e distribuição são cruciais para o controle de doenças animais e, no caso de D. immitis e Dirofilaria repens, também para o controlo de doenças potencialmente zoonóticas. Contudo, em Portugal, a informação existente à data de início deste trabalho era escassa e pontual. Com o intuito de clarificar esta situação e colmatar esta lacuna, foi delineado o presente trabalho para caracterizar a situação da dirofilariose e da angiostrongilose em Portugal. Como primeiro objetivo pretendeu-se avaliar a prevalência atual e áreas de distribuição de Dirofilaria spp. e A. vasorum em canídeos domésticos e selvagens em Portugal. Relativamente à dirofilariose, foram testados 696 canídeos domésticos de três distritos do centro de Portugal (Coimbra, Santarém e Setúbal), durante 2011, 2012 e 2013. Para avaliação das espécies de Dirofilaria circulantes, foram utilizadas técnicas parasitológicas diretas, serológicas e moleculares. Setúbal registou a maior prevalência (24,8%), seguido de Coimbra (13,8%) e Santarém (13,2%), observando-se uma prevalência média global de 15,1%. A espécie D. immitis foi detetada nos três distritos, durante os três anos de estudo, com uma prevalência crescente. Em 2014, dada a escassez de dados epidemiológicos nas regiões transfronteiriças de Portugal e Espanha, este estudo foi alargado a mais sete distritos (i.e., Beja, Bragança, Castelo Branco, Évora, Faro, Guarda e Portalegre), envolvendo mais 248 canídeos. Beja foi o distrito que registou maior número de casos de infeção por D. immitis (8.9%), seguido pela Guarda (6,7%), Faro (2,7%) e Castelo Branco (2,5%). Não foram registados casos positivos de infeção por D. immitis em Bragança, Évora e Portalegre, e não foram observadas outras espécies de Dirofilaria em todo o País. No total observou-se uma prevalência global de 11,9% de cães positivos a D. immitis nos dez distritos, um valor superior comparativamente ao reportado anteriormente. No que respeita à angiostrongilose, foi efetuado o primeiro rastreio serológico nacional de infeção por A. vasorum. Foram testados 906 canídeos domésticos provenientes de 16 distritos (i.e., Beja, Braga, Bragança, Castelo Branco, Coimbra, Évora, Faro, Guarda, Lisboa, Portalegre, Porto, Santarém, Setúbal, Viana do Castelo, Vila Real e Viseu). Foi utilizada a nova técnica de imunoabsorção enzimática (ELISA) de elevada sensibilidade para deteção de antigénios circulantes de A. vasorum e de anticorpos específicos contra este parasita. Observou-se um total de 0,7% de animais positivos simultaneamente para antigénio e anticorpo, dispersos pelas zonas norte, centro e sul de Portugal, indicando a presença de infeções ativas de A. vasorum distribuídas pelo País. Adicionalmente observou-se 1,3% de animais positivos apenas para anticorpo de A. vasorum, sugerindo uma exposição prévia ao parasita. No geral, esta prevalência foi semelhante à registada noutros países europeus. Este rastreio permitiu não só confirmar a endemicidade de A. vasorum em cães de diferentes zonas geográficas de Portugal, como colmatar a lacuna de conhecimento deste parasita em Portugal. Atendendo ao facto de os cães militares constituírem um grupo de risco de exposição a doenças transmitidas por vetores pela natureza da sua atividade e longos períodos de permanência no exterior, foi efetuado um rastreio de infeção por D. immitis e A. vasorum à população de canídeos da Força Aérea Portuguesa. Foram testados 100 animais, mantidos em bases militares localizadas em Aveiro, Beja, Leiria, Lisboa, Setúbal, Madeira e Açores. Dos animais testados, 5% apresentaram anticorpos específicos contra A. vasorum (Aveiro, Lisboa e Setúbal) e 1% antigénios circulantes de A. vasorum. Não foram observados casos de infeção para D. immitis. Este rastreio permitiu alargar a informação sobre a presença e distribuição geográfica de D. immitis e A. vasorum em Portugal. Com o objetivo de avaliar a prevalência de D. immitis e A. vasorum em canídeos silvestres, foi efetuado um rastreio serológico a 118 raposas (Vulpes vulpes) abatidas durante a época oficial de caça, provenientes de oito distritos de Portugal, distribuídos por duas regiões: Norte (Aveiro, Braga, Bragança, Porto, Viana do Castelo e Vila Real) e Sul (Évora e Setúbal). Observou-se uma prevalência de 8,5% de animais positivos para D. immitis. Adicionalmente, foi encontrada uma prevalência de 12,7% de animais positivos para A. vasorum, dos quais 5,9% simultaneamente positivos para antigénios e anticorpos de A. vasorum, 5,1% positivos exclusivamente para antigénios de A. vasorum e 1,7% positivos exclusivamente para anticorpos de A. vasorum. Os animais positivos para dirofilariose cardiopulmonar e angiostrongilose foram detetados nas regiões Norte e Sul de Portugal, ampliando a distribuição destes agentes a nível silvestre e destacando o seu potencial papel como reservatório para carnívoros domésticos. Embora os hospedeiros definitivos da dirofilariose sejam principalmente canídeos domésticos e selvagens, D. immitis apresenta baixa especificidade de hospedeiro vertebrado, sendo capaz de infetar outras espécies de mamíferos silvestres, incluindo aquáticos. Durante a execução deste trabalho, surgiu a possibilidade de rastrear uma população de pinípedes mantidos num parque oceanográfico no Algarve. Foi encontrado DNA de D. immitis em três espécies distintas (focas comuns, leões-marinhos Californianos e Otárias Sul-Africanas), com uma prevalência global de 43.8%, e foi pela primeira vez documentada a Otária Sul Africana (Arctocephalus pusillus pusillus) como hospedeiro de D. immitis. Tendo em conta as múltiplas implicações da bactéria Wolbachia spp. na patogénese da dirofilariose, outro dos objetivos deste projeto consistiu na pesquisa deste agente em canídeos domésticos, naturalmente infetados com D. immitis em Portugal. Utilizando métodos de deteção molecular, foi encontrado DNA de Wolbachia pipientis em 52,6% de amostras testadas, tendo-se deste modo efetuado a descrição deste endosimbionte em populações caninas em Portugal. Adicionalmente, foram utilizadas ferramentas geoespaciais para avaliação do risco de transmissão de dirofilariose em Portugal, utilizando o modelo graus-dia. Recorreu-se aos valores médios diários de temperaturas registados na última década (de 2003 a 2013), em cinco estações meteorológicas: Faro, Funchal, Lisboa, Porto e São Miguel. Consideraram-se como pré-requisitos um limiar de temperatura de 14°C, 130 unidades de desenvolvimento de Dirofilaria spp., e uma expetativa máxima de vida dos vetores de 30 dias. A região da Madeira foi a que registou um maior número de dias com condições compatíveis à transmissão de D. immitis (média de 209,9 dias/ano), seguida de Faro (175,2 dias/ano), Lisboa (163,5 dias/ano), Açores (140 dias/ano) e Porto (117,2 dias/ano). Observou-se também na última década um período médio de risco de transmissão desta parasitose de 8 meses/ano na Madeira, 6,9 meses/ano em Faro, 6,4 meses/ano em Lisboa, 5,6 meses/ano nos Açores e de 5 meses/ano no Porto. Dada a elevada virulência de D. immitis e complicações tromboembólicas associadas, outro dos objetivos deste estudo consistiu na elaboração de uma nova abordagem terapêutica minimamente invasiva. Para isso, desenvolveu-se um método não traumático de remoção percutânea de vermes adultos de D. immitis, baseado na utilização de fio coronário para extração de espécimes de vermes da artéria pulmonar e ventrículo direito, que se revelou eficaz. Outros dos objetivos deste trabalho consistiu em caracterizar as práticas de desparasitação e o conhecimento dos proprietários de animais de companhia sobre doenças parasitárias, tendo sido efetuado um questionário aos utentes do Hospital da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Lisboa. Observou-se que apesar da generalidade dos proprietários desparasitar o seu animal, esta prática é efetuada a intervalos irregulares e consequentemente ineficazes: apenas 11,8% dos cães são desparasitados internamente com a periodicidade aconselhada (i.e., mínimo trimestral) e apenas 28,4% estão protegidos continuamente ao longo do ano contra artrópodes. Adicionalmente 37% refere não efetuar a recolha de dejetos dos seus cães em todos os locais públicos, contribuindo para a contaminação ambiental. O nível de conhecimento público sobre parasitas e doenças parasitárias ainda é reduzido no País, com 88% dos donos afirmando nunca ter ouviu falar de "verme do coração" e 85% de "zoonose". Como corolário deste trabalho, foi efetuada uma caracterização da situação epidemiológica nacional da dirofilariose e da angiostrongilose cardiopulmonar em canídeos nos últimos vinte anos. Conclui-se que apesar do risco de exposição dos carnívoros ser variável de acordo com a região geográfica de Portugal, a probabilidade de infeção por D. immitis e A. vasorum é considerável em todo o País, ainda que se observe uma prevalência de D. immitis muito superior à de A. vasorum. Tendo em conta as atuais alterações climáticas e sociodemográficas, prevê-se um aumento do risco de infeção por estes agentes em áreas endémicas e não endémicas. Atendendo à gravidade da patologia provocada por D. immitis e A. vasorum e considerando o potencial zoonótico e impacto em saúde pública da Dirofilaria spp., estes dados alertam para a necessidade de sensibilização da comunidade médico-veterinária e da população em geral, para a realização de uma profilaxia anti-parasitária dirigida e regular em animais de companhia em Portugal.

Institut für Parasitologie, Universität Zürich, as well as from Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, for laboratory materials and reagents.

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