Impact of leporid viral diseases in Iberian ecosystems : emergence, pathophysiology, prophylaxis and diagnosis

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Saúde Animal, área científica de Sanidade Animal

ABSTRACT - The alarming state of conservation of leporid species in the Iberian Peninsula justifies the adoption in this Doctoral Thesis of an integrative approach that includes the study of different aspects of the virus-host-environment interfaces with respect to the main viral pathogens of the wild rabbit (Oryctolagus cuniculus algirus) and the Iberian hare (Lepus granatensis) in Mediterranean ecosystems. The studies to which this thesis refers to have used and developed methodologies of molecular and cellular biology, genetics, virology, immunology and pathology, applied to the wild rabbit and the Iberian hare, establishing as objectives of this Thesis the pathophysiological research of the diseases caused by rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV2), myxoma virus (MYXV) and leporid gammaherpesvirus 5 (LeHV-5), their impact on affected species, the design of new diagnostic methods and the search for control measures to mitigate the effects of these agents. In addition to reflecting on the correct interpretation of molecular diagnoses in the context of the virus-host relationship, as a previous step to the presentation of the experimental results, some methodologies have been developed which were necessary for their implementation, such as the extraction of blood through the external jugular vein in wild rabbits and Iberian hares, or simple procedures in order to obtain primary cultures from leporid fibroblasts. In this thesis it has been shown that the Eurasian badger (Meles meles) is susceptible to RHDV2 and that this species can act as a potential reservoir of the rabbit hemorrhagic disease virus. It was also shown that the same RHDV2 strain isolated from badgers could infect a dwarf rabbit, who had a prolonged (atypical) illness and a history of vaccination ineffectiveness with a commercial RHDV vaccine still available on the Portuguese market. With regard to myxomatosis, this thesis includes the detection and analysis of the first cases of this disease in Iberian hares, associated with a natural recombinant strain of the virus (ha-MYXV), as well as the first demonstration that the recombinant virus of hares can infect both wild and domestic rabbits. Additionally, evidence of the first cases of co-infection of the recombinant virus ha-MYXV and the classic myxoma virus MYXV is reported, both in wild rabbits and in Iberian hares. In an attempt to provide solutions for the control of myxomatosis in wild leporids, it has been shown that commercial homologous vaccines against myxomatosis are effective in wild rabbits against the new naturally recombinant strain ha-MYXV, but failed to protect the Iberian hare against myxomatosis. ...

RESUMO - Título da Tese: Impacto das doenças virais dos leporídeos nos ecossistemas Ibéricos : emergência, patofisiologia, profilaxia e diagnóstico - O estado alarmante de conservação das espécies de leporídeos na Península Ibérica justifica a adopção nesta Tese de Doutoramento de uma abordagem integrativa que inclui o estudo de diferentes aspectos das interfaces vírus-hospedeiro-ambiente relativos aos principais agentes patogénicos virais do coelho-bravo (Oryctolagus cuniculus algirus) e da lebre ibérica (Lepus granatensis) nos ecossistemas mediterrânicos. Os estudos referidos nesta tese aplicaram e refinaram metodologias de biologia molecular e celular, genética, virologia, imunologia e patologia, aplicadas ao coelho-bravo e à lebre ibérica, estabelecendo-se como objectivos desta tese a investigação fisiopatológica das doenças causadas pelo vírus da doença hemorrágica do coelho (RHDV2), pelo vírus da mixomatose (MYXV) e pelo leporid gammaherpesvirus 5 (LeHV-5), os seus impactos nas espécies afetadas, o desenho de novos métodos de diagnóstico e a procura de soluções para mitigar os efeitos desses agentes nas populações selvagens de leporideos. Além de refletir sobre a correta interpretação dos diagnósticos moleculares no contexto da relação vírus-hospedeiro, como etapa preliminar à apresentação do próprio trabalho experimental, foram desenvolvidas e implementadas algumas metodologias necessárias ao seu desenvolvimento dos estudos subsequentes, como a extração de sangue através da veia jugular externa em coelho-bravo e lebre-ibérica, ou procedimentos simples para obtenção de culturas primárias de fibroblastos de leporídeos. Nesta Tese foi demonstrado que o texugo euro-asiático (Meles meles) é suscetível ao RHDV2 e que esta espécie animal pode atuar como um potencial reservatório do vírus da doença hemorrágica do coelho. A mesma estirpe de RHDV2 isolada de texugos foi identificada num coelho anão que apresentava doença prolongada (atípica) e histórico de falha vacinal com uma vacina comercial RHDV, na altura disponível no mercado português. No que diz respeito à mixomatose, esta Tese inclui a detecção e análise dos primeiros casos desta doença em lebre-ibérica, associada a uma estirpe naturalmente recombinante do vírus (ha-MYXV), bem como a primeira demonstração de que este vírus recombinante de lebres pode também infectar coelhos selvagens e domésticos. Adicionalmente, foram recolhidas evidências dos primeiros casos de co-infecção do vírus recombinante ha-MYXV e do vírus do mixoma clássico (MYXV), tanto em coelho-bravo como em lebre-ibérica. Na tentativa de fornecer soluções para o controlo da mixomatose em leporídeos selvagens, foi demonstrado que as vacinas homólogas comerciais contra a mixomatose são eficazes no coelho-bravo contra a nova estirpe naturalmente recombinante ha-MYXV mas não protegem contra a mixomatose na lebre. Esses estudos revelaram o potencial protetor de uma vacina heteróloga comercial contra a mixomatose em lebre-ibérica, principalmente quando a dose da vacina é aumentada. Para a monitorização e caracterização dos diferentes tipos de vírus responsáveis pela mixomatose em leporídeos, foi desenvolvido um sistema de qPCR multiplex que permite a rápida deteção e diferenciação entre estirpes clássicas de MYXV e ha-MYXV, recombinante natural. No decurso da investigação sobre mixomatose na lebre-ibérica, foi detectada, pela primeira vez neste género, a presença de um herpesvírus, denominado Leporid gammaherpesvirus 5, para cuja detecção foi desenvolvido e validado um método de diagnóstico baseado em qPCR, utilizando sistemas Evagreen ou sondas de hidrólise. Os diferentes estudos realizados permitiram, em primeiro lugar, reconhecer o estado alarmante de conservação da lebre-ibérica na Península Ibérica devido à exposição a múltiplos agentes patogénicos endémicos e emergentes, exemplificado pela emergência nos últimos três anos do vírus da mixomatose (ha-MYXV) naturalmente recombinante, pela detecção do mesmo vírus em coelhos selvagens e pela identificação de um novo herpesvírus em lebre, entre outros agentes de origem bacteriológica e parasitária, que não foram objeto desta tese. Em segundo lugar, essas descobertas permitiram entender o quanto ainda há a ser investigado na caracterização do estado das populações selvagens em geral e do coelho-europeu e das lebres em particular. Por último, mas não menos importante, as evidências recolhidas nesta Tese corroboram a necessidade do pleno reconhecimento por parte da sociedade civil, classe política e entidades governamentais, do valor destas espécies e das gravíssimas consequências que o seu estado atual está a ter na biodiversidade e na manutenção das espécies do ecossistema mediterrâneo.

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