Development and application of low-cost and environment-friendly techniques for fish sperm cryopreservation | Desenvolvimento e aplicação de técnicas de baixo custo e impacto ambiental para criopreservação de sêmen de peixes

Fish sperm cryopreservation is a technique that can increase the reproduction in captive efficiency of fishes. Over the last few decades, protocols for sperm cryopreservation from many fishes have been established. However, the researchers neglecting the period in which the gametes remain in contact with the cryoprotective solution until fertilization. Exposure of sperm to cryoprotectant solutions after thawing can be toxic to the gametes.The vast majority of the established protocols use ultra-resistant plastic containers to store sperm during the cryopreservation process. These containers usually are not reused, generating highly polluting waste for the environment. Thus, the main objective of the thesis was to create and test low-cost methodologies that enhance the use of fish post-thaw sperm and make the sperm cryopreservation process more environmentally friendly.The experiments in the Chapters 2 and 3were developed in Brazil. We used the South American silver catfish Rhamdia quelen, a species considered an experimental model for native South American fishes. In vitro fertilization and sperm cryopreservation protocols for the species were already established; thus, we based our work on these protocols to apply innovations. In Chapter 2, we tested the use of post-thawing dilution to reduce the toxicity of the cryoprotectant solution. This technique is commonly used in mammalian sperm cryopreservation protocols but has never before been applied to post-thaw sperm of South American fishes. South American silver catfish post-thaw sperm samples were diluted in a saline extender (NaCl). The post-thaw sperm diluted samples showed higher velocitiesand reproductive capacitythan the undiluted samples (control). Thus, the post-thawing sperm dilution methodology should be included in the silver catfish sperm cryopreservation protocol. In Chapters 3 and 4, we developed, tested, and described the methodology for using biodegradable gelatin (collagen) and hypromellose (HPMC) capsules as an alternative container to plastic straws in the fish sperm cryopreservation. In the second chapter, we observed that the biodegradable capsules maintained the kinetic parameters and reproductive capacity of South American silver catfish sperm just as effectively as plastic straws. The results indicated that the capsules could be an alternative container to plastic straws in the silver catfish sperm cryopreservation.The experimental procedures in Chapter 4were performedin Spain. We apply the methodology developed in Chapter 3 to the cryopreservation of sperm from European eel Anguilla anguilla, gilthead seabream Sparus aurata, and European sea bass Dicentrarchus labrax. In these threespecies, biodegradable capsules preserved the sperm kinetic parameters and membrane integrity just as effectively plastic straws. We observed that DNA damage in European eel and European sea bass sperm samples cryopreserved in capsules and straws did not differ. On the other hand, gilthead seabream sperm samples showed higher DNA damage than those cryopreserved in straws. However, the damage level observed in samples stored in capsules is considered low, thus, may not compromise embryonic development. We observed the results and concluded that biodegradable gelatin and HPMC capsules could be used as alternative containers to plastic straws for sperm cryopreservation from the three aquaculture Mediterranean fish species.

A criopreservação de sêmen de peixes é uma técnica que pode aumentar a eficiência da reprodução em cativeiro de espécies de peixes. Durante as últimas décadas, foram estabelecidos protocolos para criopreservação do sêmen de diversas espécies peixes. Porém, os pesquisadores negligenciam o período em que os gametas ficam em contato com a solução crioprotetora após o descongelamento. A exposição dos espermatozoides às soluções crioprotetoras após o descongelamento pode ser tóxica às células.A maioria dos protocolos estabelecidos utilizam recipientes plásticos ultra resistentes para armazenar o sêmen durante a criopreservação. Esses recipientes normalmente não são reutilizados, gerando resíduos altamente poluentes ao meio ambiente. Assim, o principal objetivo da tese foi criar e testar metodologias de baixo custo que potencializem o uso de espermatozoides descongelados de peixes e torne o processo de criopreservação de sêmen menos poluente ao meio ambiente. Nos experimentos dos capítulos 2 e 3 utilizamos o jundiá cinza Rhamdia quelen, espécie considerada modelo experimental para os peixes nativos sul-americanos. No capítulo 2, testamos o uso da diluição do sêmen descongelado para diminuir a toxicidade da solução crioprotetora. As amostras descongeladas de sêmen de jundiá cinza foram diluídas em um diluidor salino (NaCl). Observamos que os espermatozoides das amostras diluídas apresentaram maiores velocidades e capacidade reprodutiva que as amostras não diluídas. Desta forma, a diluição do sêmen descongelado de jundiá se mostrou que deve ser incluída no protocolo de criopreservação do sêmen da espécie. Nos capítulos 3 e 4 desenvolvemos e testamos a metodologia de uso das cápsulas de gelatina e das cápsulas de hipromelos e como um recipiente alternativo ao uso das palhetas plásticas na criopreservação do sêmen de peixes. No segundo capítulo, observamos que as cápsulas biodegradáveis mantiveram os parâmetros cinéticos e a capacidade reprodutiva dos espermatozoides de jundiá cinza tão bem quanto as palhetas plásticas. Assim, as cápsulas podem ser utilizadas como um recipiente alternativo ao uso das palhetas plásticas na criopreservação de sêmen dessa espécie.O experimento do capítulo 4 foi realizado na Espanha. Nós aplicamos a metodologia desenvolvida no capítulo 3 para a criopreservação do sêmen de enguia europeia Anguilla anguilla, dourada Sparus aurata e robalo europeu Dicentrarchus labrax. Nessas três espécies, as cápsulas biodegradáveis preservaram os parâmetros cinéticos e a integridade de membrana dos espermatozoides tão bem quanto as palhetas plásticas. Observamos que os danos de DNA das amostras de sêmen de enguia europeia e robalo europeu criopreservadas em cápsulas e palhetas não se diferiram. Por outro lado, as amostras de sêmen de dourada mostraram maior dano de DNA. Porém, o nível de dano que observamos nas amostras armazenadas em cápsulas é considerado baixo, assim podem não comprometer o desenvolvimento embrionário. Concluímos que as cápsulas de gelatina e as cápsulas biodegradáveis de hipromelos e podem ser utilizadas como recipientes alternativos ao uso das palhetas plásticas para a criopreservação do sêmen das três espécies de peixes mediterrâneas.