Expression and purification of pyruvate transporting human mitochondrial pyruvate carrier (MPC) protein complex for structural studies

Английский. Pyruvate is one of the main molecules needed for the citric acid cycle, which produces energy in the form of ATP. The citric acid cycle reaction occurs in the mitochondrial matrix, and for pyruvate to participate in the reaction, it needs to be transported from the cytosol across the mitochondrial membranes into the mitochondrial matrix. A special membrane protein called the mitochondrial pyruvate carrier (MPC) transports pyruvate across the inner membrane of the mitochondria, while pores in the outer mitochondrial membrane allows smaller molecules to diffuse over it. The MPC is made of two proteins, MPC1, and MPC2. The aim of this project is to characterize the structure and functionality of the mitochondrial pyruvate carrier. In this study, the Hu-MPC1 and Hu-MPC2 proteins were expressed separately in Pichia pastoris, and then individual and combined protein assays were performed. The assays include SDS-PAGE, Native-PAGE, Western Blot, and Mass spectrometry. To enable chromatography and assays of the proteins, the Hu-MPC1 was tagged with a Strep-tag II at the C-terminal and the Hu-MPC2 was tagged with a His-tag at the C-terminal. The results suggests that a heterodimer complex was formed between Hu-MPC1 and Hu-MPC2. Further research is desired with Hu-MPC1 induction for 24 hours to see if it is possible to produce a larger amount of protein. Further assays are necessary with Hu-MPC1 and Hu-MPC2 and as a complex, to gain more knowledge regarding the complex formation of the two subunits and their dimerization capabilities. Lastly, further studies are essential with purification optimization of Hu-MPC1 and Hu-MPC2, and usage of Cryo-EM or X-ray crystallography to solve the structure of the Hu-MPC complex and subunits.

Шведский. Litet protein med ett stort syfte En grundförutsättning för mänskligt liv är föda. Maten vi intar omvandlas till energi som möjliggör alla kroppsliga funktioner. Den största delen av maten vi äter är kolhydrater. Kolhydraterna bryts ner till glukos som sedan bryts ner till pyruvat, en viktig intermediär i energimetabolismen. Pyruvat är en molekyl som transporteras från våra cellers cytosol till mitokondrien. Mitokondrien är cellernas ”kraftverk”. Mitokondrien har två dubbelskiktade skyddslager på sin utsida som består av fett. Det yttre membranet är enkelt att korsa för pyruvat, men för att transporteras över det inre membranet krävs det hjälp. Pyruvat får hjälp av ett protein som agerar som en tunnel med begränsad behörighet beroende på vilken molekyl som vill igenom. Proteinet i fråga kallas för mitokondriala pyruvatbäraren, eller MPC. MPC är ett membranproteinkomplex som består av två proteiner, MPC1 och MPC2. MPC kan inhiberas med läkemedel som förhindrar eller saktar ner sjukdomsutvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar och diabetes typ 2. De läkemedel som erbjuds idag ger flertalet bieffekter och därför skulle nya läkemedel behövas. Syftet med denna studie är att lösa proteinstrukturen av MPC så att fler läkemedel kan forskas fram. Utförandet För att kunna studera MPC-proteinerna användes jästceller som man fick till att producera proteinerna. MPC1 och MPC2 renades upp separat så att man kan studera dem åtskilt. Ett försök i att isolera MPC1 misslyckades och man valde därför att blanda de två proteinerna med förhoppningen att de skulle binda till varandra och skapa ett komplex. Interaktionen mellan MPC1 och MPC2 analyserades med SDS-PAGE, westernblot och masspektrometri. SDS-PAGE är en metod som analyserar storleken på proteiner i ett prov. Westernblot bygger vidare på SDS-PAGE genom att binda specifika antikroppar som kan detektera MPC1 och MPC2. Masspektrometri är en metod som mäter massan av molekyler som finns i ett prov. Med de tre analytiska metoderna kunde det avgöras att MPC1 och MPC2 hade skapat ett komplex. Men för att kunna utveckla läkemedel måste strukturen lösas, vilket kräver att fler studier utförs. Den här studien skulle också behöva upprepas, men vissa delar av utförandet måste optimeras för att få tydligare resultat. De nya studierna kommer då förhoppningsvis lyckas isolera MPC komplexet så att det kan avbildas med ett elektronmikroskop och därigenom lösa 3D-strukturen av proteinet. Magisterexamensprojekt i Molekylärbiologi 30 hp 2022 Biologiska institutionen, Lunds universitet Handledare: Susanna Törnroth-Horsefield Kemiska institutionen