Citometria de fluxo, análises ultraestruturais e bioquímica de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) de Cattleya tigrina A. Richard

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2017.

A orquídea Cattleya tigrina encontra-se dispersa no bioma Mata Atlântica sendo uma espécie considerada vulnerável à extinção segundo a Resolução da SMA do Estado de São Paulo e se encontra na lista vermelha da flora do Rio Grande do Sul. Devido ao seu valor ornamental, torna se alvo da ação predatória de colecionadores e orquidófilos. Com sua população em declínio reforça-se a necessidade de estudos para entendimento e conservação da espécie. A cultura de tecidos vegetais engloba um conjunto de ferramentas biotecnológicas que possibilitam a conservação e melhoramento genético de plantas. Por ser uma espécie vulnerável a extinção e endêmica da Mata Atlântica, C. tigrina foi utilizada como modelo nesse estudo. Uma das rotas morfogênicas de regeneração in vitro de orquídeas ocorre durante a formação de Estruturas Semelhantes a Protocormos (ESPs) e pode ser empregada para a propagação massal. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi caracterizar o padrão de desenvolvimento das ESPs através de análises ultraestruturais, citometria de fluxo (CF) e bioquímica em diferentes estádios de formação e regeneração de C. tigrina. Explantes foliares, obtidos de plantas in vitro foram inoculados em meio de cultura MS/2 suplementado com 9µM de TDZ, para a indução e desenvolvimento das ESPs. As culturas foram coletadas aos 7, 14, 21, 30, 60, 120 e 180 dias de cultivo para posteriores análises. As análises de CF foram realizadas mediante a combinação de observações durante a morfo histodiferenciação em diferentes regiões da planta. Durante a indução e desenvolvimento das ESPs foram realizadas análises histológicas em microscopia de luz (ML) e em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Adicionalmente, foram quantificados também, os carboidratos solúveis totais e amido, níveis de clorofilas a, b e carotenoides. A partir da CF foi possível verificar a estabilidade da espécie mantida in vitro, bem como as alterações anatômicas, bioquímicas e metabólicas durante a indução e desenvolvimento das ESPs. Os resultados alcançados permitiram inferir que as ESPs de C. tigrina possuem um conteúdo semelhante, do valor C de DNA, durante as primeiras semanas de indução. O estudo histológico revelou que as ESPs são estruturas formadas por células meristemáticas e a protoderme contém células que estão em constante divisão, com um citoplasma denso e núcleos proeminentes. Em MET observa-se que as células apresentam organelas como mitocôndrias de vários tamanhos e formas, núcleos grandes com nucléolo, abundância de amiloplastos nos estádios iniciais de desenvolvimento das ESPs e cloroplastos. Durante o desenvolvimento das ESPs ocorreu uma diminuição no teor de clorofilas a e b, porém, a razão de clorofilas a/b se manteve em todos os tratamentos. Os maiores teores de amido nas células das culturas foram registrados aos 14 dias de cultivo em meio de cultura isento de regulador de crescimento vegetal (RCV). A partir disto, observou-se um decréscimo do teor de amido. Este evento pode estar relacionado com a degradação deste composto para o suprimento energético durante a manutenção do crescimento celular. Assim, as características celulares observadas nos estudos ultraestruturais e de CF descrevem e ampliam a base científica para a compreensão dos fatores que modulam o processo de indução e desenvolvimento das ESPs em C. tigrina. Além disso, estas informações são de grande importância para a otimização do processo de propagação e regeneração, principalmente, por se tratar de uma espécie de orquídea endêmica da Mata Atlântica do sul do Brasil, de grande valor ornamental e por ser considerada vulnerável à extinção.<br>

Abstract : The Cattleya tigrina orchid is found in the Atlantic Forest biome. A species considered vulnerable to extinction, according to the SMA Resolution of the São Paulo State, and to the red list of the flora of Rio Grande do Sul. Due to its ornamental value, it has become a target of predatory actions of collectors and orchidophiles. Its declining population reinforces the studies to understand and to conserve the species. The plant tissue culture comprises a set of biotechnological tools that allows its genetic improvement and the conservation of the plants. Because it is a species vulnerable to extinction and endemic to the Atlantic Forest, C. tigrina was used as a model in this study. One of the morphogenetic route of in vitro regeneration of orchids occur during the formation of Protocorm-like bodies (PLBs), and can be used for mass propagation. In this context, the objective of the study was to define the pattern of development of PLBs by ultrastructural analysis, flow cytometry (FC) and biochemistry at different stages of formation and regeneration of C. tigrina. Leaf explants obtained from young plants micropropagated in vitro were inoculated into culture medium MS/2 supplemented with 9µM TDZ for the induction and development of PLBs. The cultures were collected after 7, 14, 30, 60, 120 and 180 days of cultivation for further analysis. FC analyses were performed with morphological histodifferentiation observations in different regions of the plant. During the induction and development of PLBs, histological analyses were performed in Light Microscopy (LM) and in Transmission Electron Microscopy (TEM). Total soluble carbohydrates and starch, levels of chlorophyll a, b and carotenoids were also quantified. In FC, the stability of the species maintained in vitro could be verified. Just as the anatomical, biochemical and metabolic alterations during the induction and development of PLBs. The results allowed to infer that the PLBs of C. tigrina have a similar content, of the C value of DNA, during the first weeks of induction. The histological study revealed that PLBs are structures formed by meristematic cells. And the protoderm contains cells that are in a constant division, with a dense cytoplasm and prominent nuclei. In TEM analyses, mitochondria of various sizes and shapes, large nuclei with nucleolus, amyloplasts in the early stages of development of PLBs and chloroplasts were observed. During the development of PLBs there was a decrease in chlorophyll a and b, and chlorophyll a/b ratio was maintained in all treatments. The highest levels of starch were recorded at 14 days of culture in plant growth regulator (PGR) free medium. A decrease in the starch content was observed. May be related to the degradation of this compound to the energetic supply during cell growth maintenance. Cellular characteristics observed in ultrastructural and FC studies describe and extend the scientific basis for understanding the factors that modulate the induction and development process of PLBs in C. tigrina. This information is important for optimizing the process of propagation and regeneration. Mainly because it's an endemic orchid of the Atlantic Forest in southern Brazil, of great ornamental value and considered vulnerable to extinction.