Extração, caracterização química e avaliação da atividade imunomoduladora de polissacarídeos de aveia-branca (Avena sativa L.) sobre a via clássica do sistema complemento humano

Orientador : Prof. Dr. Marcelo Beltrão Molento

Co-orientadora : Profª. Drª. Juliana Bello Baron Maurer

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Defesa: Curitiba, 23/02/2017

Inclui referências

Resumo: Entre os cereais, a aveia-branca (Avena sativa L) e um cereal com grande importancia nutricional e nutraceutica tanto para humanos como animais. As glucanas sao os principais constituintes da parede celular dos cereais e apresentam blocos de glucose unidos por ligacoes glicosidicas (? 1?3) e (? 1?6), por isso sao denominadas ?-glucanas e possuem importante funcao no sistema imunologico. Varios trabalhos descrevem relatos que demonstram o potencial prebiotico e imunomodulador das ?-glucanas. Assim considerando o previamente abordado, a hipotese do presente trabalho e que as glucanas de aveias apresentam potencial imunomodulador sobre a via classica do sistema complemento. Esta dissertacao esta organizada em 3 capitulos. O primeiro corresponde uma revisao (capitulo 1) e teve por objetivo abordar a atividade imunomoduladora e como prebiotico de ?-glucanas de aveia-branca. O objetivo do capitulo 2, foi demonstrar a extracao e a caracterizacao quimica de polissacarideos de aveia. Foram realizadas duas extracoes aquosas em temperatura ambiente (25oC) (ASW1 e ASW2) e uma na forma alcalina (ASNaOH). As fracoes obtidas foram analisadas em relacao ao teor de carboidratos totais, proteina total e fenois totais. Todas as fracoes apresentaram alto teor de carboidratos (> 60%), quantidades minimas de proteinas (0,24%) e fenois (0,04%). A cromatografia de camada delgada foi realizada para determinar a composicao de monossacarideos, a qual apresentou apenas glucose como constituinte. A espectroscopia de ressonancia magnetica nuclear (RMN) de carbono treze (13C) foi aplicada para determinar os aspectos estruturais das fracoes polissacaridicas. Os resultados sugerem que a fracao ASW1 apresenta-se constituida de ?-glucanas (1?3) e (1?4) e a fracao ASNaOH apresenta alem da ?-glucana tambem polissacarideos amilaceos (amilose e amilopectina), caracterizadas como ?-glucana (1?4) e (1?6). A extracao utilizada foi eficiente para a obtencao de fracoes abundantes em ?-glucana (com rendimento de cerca de 2%), as quais poderao ser utilizadas em pesquisa com nutraceuticos. O capitulo 3 teve por objetivo, investigar o efeito das fracoes de aveia - ASNaOH e ASNaOHt sobre a via classica do sistema complemento humano, utilizando o teste in vitro de fixacao do complemento. A heparina (glicosaminoglicano sulfatado, origem suina) e o zimozam (zymozan, ?-glucana de Saccharomyces cerevisiae) foram utilizados respectivamente como controle inibidor e ativador da via classica do sistema complemento. As fracoes ASNaOHt, ASNaOH e zimozam nao apresentaram diferenca significativa (P>0,05) em ambos os ensaios de fixacao do complemento (sem e com pre-incubacao). No entanto, a fracao ASNaOHt apresentou ICH50 relativamente menor, o que indica que o potencial dose-resposta dessa fracao foi maior que o apresentado pelas outras, pois uma dose menor apresentou o mesmo efeito quando comparadas. Em relacao ao controle inibidor (heparina), as demais fracoes apresentaram-se iguais no ensaio com pre-incubacao e mais eficazes no ensaio sem pre-incubacao, o que indica que essas amostras, a partir da via classica, sao capazes de ativar o sistema complemento e nao de inibi-lo, como a heparina. No presente estudo, demonstrou-se a capacidade das ?-glucanas obtidas de aveia, ativando a via classica do sistema complemento humano, apresentando-se como uma importante estrategia terapeutica na saude animal e humana. Palavras-chave: ?-glucanas, sistema complemento, fitoterapia, imunoestimulante

Abstract: Among the grains, white oat (Avena sativa L.) is a cereal with nutritional and nutraceutical importance for both humans and animals. Glucans are the main constituents of the cell wall of cereals and have glucose blocks bound by glycosidic bonds (?1->3) and (?1->6) These molecules are called ?-glucans and have an important function in the immune system. Several scientific reports already been described the prebiotic and immunomodulatory potential of ?-glucans. Thus, considering the previously discussed, the hypothesis of the present work is that the glucans of white oat present immunomodulatory potential on the classic pathway of the complement system. This master thesis is organized into three chapters. The first one corresponds to a review (chapter 1) and aimed to discuss the immunomodulatory activity of white oat ?-glucans as a prebiotic. The objective of Chapter 2 was to demonstrate the extraction and chemical characterization of oat polysaccharides. Two aqueous extractions were performed at room temperature (25 ° C) (ASW1 and ASW2) and one in alkaline form (ASNaOH). The obtained fractions were analyzed for total carbohydrate content, total protein and total phenols. All fractions presented high carbohydrate content (> 60%), minimum amounts of proteins (0.24%) and phenols (0.04%). Thin layer chromatography was performed to determine the composition of monosaccharides; the results revealed only glucose as constituent. Thirteen (13 C) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was applied to determine the structural aspects of the polysaccharide fractions. The results demonstrated that the ASW1 fraction consists of ?-glucans (1-3) and (1-4). The ASNaOH fraction presented, in addition to ?- glucan, also amylose and amylopectin polysaccharides, characterized as ?-glucan (1-4) and (1-6). The extraction was efficient to obtain abundant ?-glucan fractions (yield about 2%), which could be used in nutraceutical research. The chapter 3 was developed to investigate the effect of oat fractions - ASNaOH and ASNaOHt on the classical pathway of the human complement system, using the in vitro complement fixation test. Heparin (sulfated glycosaminoglycan, porcine origin) and zymozan (zymozan, ?-glucan of Saccharomyces cerevisiae) were used, respectively, as inhibitory and activator control of the classical pathway of the complement system. The ASNaOHt, ASNaOH and zimozam fractions showed no significant difference (P> 0.05) in both complement fixation assays (without and with preincubation). However, the ASNaOHt fraction had relatively lower ICH 50, it indicates that the potential dose-response of the ?-glucan fraction was higher than that presented by the others, because a lower dose had the same effect when compared. In relation to the inhibitor control (heparin), the other fractions were the same in the preincubation test and more effective in the assay without preincubation, it indicates that these samples, from the classical pathway, are able to activate the complement system and not inhibit it, such as heparin. In the present study, was demonstrated the ability of ?- glucans, obtained from oat, to activate the classical pathway of the human complement system, it highlights these molecules as important therapeutic strategy in animal and human health. Key words: ?-glucans, complement system, phytotherapy, immune-stimulant