In vivo Hybridisierung einer Mausleber | Vergleich der Transplantation humaner Hepatozyten und Progenitorzellen aus explantierten Lebern versus Leberteilresektaten im Mausmodell | In vivo hybridisation of a mouse liver. Comparison transplantation of human hepatocytes and progenitor cells from explanted livers versus partial liver resectates in a mouse model

Die orthotope Lebertransplantation ist das Standardtherapieverfahren bei terminalem Leberversagen. Auf Grund von anhaltendem Spenderorganmangel, dem Risiko von Abstoßungsreaktionen und dem Nebenwirkungsprofil der notwendigen Immunsuppression besteht der dringende Bedarf nach Optimierung des Transplantationsverfahrens und Alternativen wie der Leberzelltransplantation. Das übergeordnete Ziel des Projektes in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist es, orthotope allogene Transplantate mit autologen Hepatozyten und Vorläuferzellen zu besiedeln und somit eine sogenannte neohybride Leber zu schaffen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss der Zellquelle auf die Neohybridisierung der Mausleber zu vergleichen. Hierzu werden, wie bereits in Vorarbeiten der Arbeitsgruppe untersucht, die Rekolonisierungseigenschaften der Hepatozyten und Vorläuferzellen von Patienten ohne chronische Lebererkrankung (bei denen eine Leberteilresektion zur Entfernung einer Neoplasie in der Leber vorgenommen wurde) und Zellen aus erkrankten, zirrhotischen Lebern isoliert und deren unterschiedliche Rekolonisierung im Empfängertier evaluiert. Zudem soll geprüft werden, ob eine Verlängerung des Tierversuches auf 30 Tage ohne Abnahme der Überlebensrate der Versuchstiere möglich ist. Hepatozyten und Vorläuferzellen wurden isoliert, mittels Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt und bis zur Transplantation über 12 bis 24 Stunden kühl gelagert. Viabilität, Zellzahl und Verhalten in Zellkultur wurden verglichen. Parallel zur Zellisolation wurden für jede Probe je 12 FOX CHASE SCID / beige® Mäuse mit dem Pyrrolizidinalkaloid Monocrotalin (200mg / kg intraperitoneal) vorbehandelt, um eine Leberschädigung zu initiieren. 12 bis 24 Stunden später wurden die Mäuse einer 50 % igen Hepatektomie unterzogen und jeweils 1 Mio Hepatozyten und Vorläuferzellen über die Milz transplantiert. Nach 7, 15 und 30 Tagen wurden jeweils 3 Mäuse euthanasiert und die Leber entnommen. Der Rekolonisierungsnachweis wurde mittels immunhistochemischer Färbung (anti-human-Albumin) geführt. Zusätzlich erfolgte die Detektion der humanen Hepatozyten in der Mausleber mittels real time PCR (Humanalbumin, B2M und ACTN4). Die Isolierung von Hepatozyten und Vorläuferzellen gelang sowohl aus Resektaten als auch Explantaten in hoher Zellzahl und Viabilität, allerdings war die Viabilität bei den Resektaten signifikant höher. Die anschließende Kühllagerung der Zellen für 12 bis 24 Stunden konnte mit akzeptablen Verlusten der Zellviabilität durchgeführt werden. Hier schienen die Explantatzellen deutlich stabiler, so dass die Viabilität und Zellzahl beider Zellgruppen nach Kühllagerung in etwa identisch war. Auch in Zellkultur waren beide Zellquellen gleichermaßen stabil. Das etablierte Mausmodell konnte mit einer Überlebensrate von 86 % der Tiere als erfolgreich gewertet werden, wobei in der Resektatgruppe weniger Tierverluste zu verzeichnen waren, als bei den Explantaten. Der immunhistochemische Rekolonisierungsnachweis zeigte mittels Detektion von Humanalbumin bei 92 % der Tiere ein Engraftment von humanen Hepatozyten in der Mausleber in den ersten 15 Tagen in gleichem Maße in Resektat- und Explantatgruppe, an Tag 30 dann in deutlich höherer Menge bei den Explantaten. Eine Bestätigung der immunhistochemischen Ergebnisse mittels Real Time PCR gelang nur bedingt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine erfolgreiche Zellisolation, Kühllagerung und Transplantation sowohl von Hepatozyten und Vorläuferzellen aus gesundem Lebergewebe, als auch aus erkrankten, zirrhotischen Lebern möglich ist. Zudem gibt es Hinweise dafür, dass die Explantatzellen bei Kühllagerung den Resektatzellen überlegen sind und sie auch bei der Rekolonisierung über längere Zeiträume den Resektatzellen überlegen sind. Um beide Zelltypen weiter auf ihre repopulativen Eigenschaften zu untersuchen, eignet sich das in dieser Arbeit verwendete Mausmodell, zur weiteren Untersuchung der Rekolonisierung sollte und kann die Versuchsdauer für zukünftige Studien verlängert werden.

So far orthotopic liver transplantation is the standard treatment for terminal liver failure. Due to shortage of donors, the risk of rejection and the side effects of immunosuppression, there is still a need for optimizing the transplant procedure and for alternative treatments like liver cell transplantation. This work is part of a project that aims to repopulate allogen transplants with autologous hepatocytes and hepatic progenitor cells to create a so-called neohybrid liver graft. The main focus of the present dissertation is to analyse whether cell engraftment and neohybridization are dependent on the underlying disease of the donor. Additionally, it will be evaluated whether the extension of the animal experiment up to 30 days is feasible. Cells were isolated from three „healthy“ livers from patients who had undergone hepatic resections for liver metastasis and three diseased livers of patients after liver explantation. Hepatocytes and hepatic progenitor cells were isolated, purified via Percoll density gradient centrifugation and stored at 4°C for 12 to 24 hours until transplantation. Viability, total cell yield and cell culture were compared. After successful isolation, animals (12 FOX CHASE SCID/beige® per sample tissue) where pretreated with monocrotaline (200 mg/kg) intraperitoneally to initiate liver damage. 12 to 24 hours later, a 50 % partial hepatectomy was performed and 1 million hepatocytes and progenitor cells were transplanted by intrasplenic injection. Three mice of each group were euthanized on day 7, 15 and 30 after surgery and the liver was removed for further diagnostics. To test repopulation, the liver samples were evaluated histopathogically by immunhistochemical staining (anti-human-albumin) and by detection of human hepatocytes in the liver tissue via real time PCR (human albumin, B2M and ACTN4). The isolation of hepatocytes and progenitor cells was successful from both healty and diseased liver tissue, but total cell viability was significantly higher in healthy liver tissue. Cold storage for 12 to 24 hours was feasible with a small loss of viability only. The cells from diseased liver tissue seemed to tolerate cold storage better and total cell yield and viability of both groups where almost the same after cold storage. In a cell culture, both cell lines grew well. The established mouse model was successful with a survival rate of 86% of animals. The explant group that received cells from damaged liver tissue suffered from moderately higher animal losses. In 92 % of the mice immunhistochemistry showed engraftment of human hepatocytes in equal amounts in animals of the explant and resection group for the first 15 days, on day 30 in a significantly higher rate in the explant group. Confirmation of the immunohistological findings via PCR was only partly successful. The results of this study show that successful isolation, cold storage and transplantation of hepatocytes and progenitor cells from healthy liver tissue as well as from diseased, cirrhotic livers is possible. Also there are hints that cells from diseased livers are more stable in cold storage and in Long term repopulation. To compare both cell lines, the modified mouse model is suitable, however, the duration time of further studies needs to be longer than 30 days in order to properly evaluate the capacity of repopulation.