Optical fibre LSPR immunosensing: from gold nanoparticles production to biosensor characterisation | Imunodeteção por LSPR em fibra ótica: da produção de nanopartículas de ouro à caracterização do biossensor

The Localised Surface Plasmon Resonance (LSPR)-based sensors have become a leading label-free biosensing technology. Despite their prominence, these sensors still require refinement in key areas, including sensitivity, specificity, repeatability, reproducibility and configuration adaptable for point-of-care biosensing. In this dissertation, work was undertaken to improve these parameters by developing LSPR sensors in Optical Fibre (OF) in a reflection configuration. In order to achieve this objective, the following tasks were contemplated: synthesis of Gold Nanoparticles (AuNPs) of 3 different sizes (20, 40, and 80 nm); morphological and stability analysis of the NPs; production of OF probes with a 600 μm diameter; comparison of two silanes for binding AuNPs to OF (APTES vs MPTMS). Additionally, tests were conducted on the repeatability, reproducibility, and characterisation of the probes, assessing their absorbance spectrum as a function of the of surrounding environment’s Refractive Index (RI). Finally, the OF-LSPR approach with the best sensitivity and reproducibility was biofunctionalised with antibodies to test the performance of these probes as biosensors. Overall, the results showed that the probes functionalized with smaller AuNPs exhibited the best performance, achieving an average sensitivity of 3.96±0.32 Arb.u./R.I.u. over the widest consistent response range 1.3342-1.3356 R.I.u.. Repeatability and reproducibility were statistically evaluated using the Intraclass Correlation Coefficient 3 (ICC3), resulting in values of ICC3 ≥ 0.98 for both figures of merit. These results supported the viability of this approach, which combines the advantages of LSPR phenomena with the versatility of the OF reflection configuration. Subsequently, a pilot immunoassay test for Human Serum Albumin (HSA) demonstrated that the developed biosensor identifies analyte concentrations in an operating range of 0.001-10 ng/mL, with an average sensitivity of (10.5±1.9)× 10⁻⁴ Arb.u./log(ng/mL). This research corroborates and expands the existing literature, laying the foundations for methodological advances in LSPR biodetection. The inherent versatility and affordable cost of the developed immunosensor, combined with its suitability for direct, real-time monitoring of molecular interactions in low-volume samples, positions it for future integration into point-of-interest biodetection applications.

Os sensores de Ressonância de Plasmão de Superfície Localizado (LSPR, do inglês Localised Surface Plasmon Resonance) tornaram-se uma das principais tecnologias de biossensores sem rótulos, porém estes ainda devem ser aperfeiçoados: na sensibilidade, especificidade, repetibilidade, reprodutibilidade e configuração adaptável a biodeteção no ponto de interesse. Nesta dissertação, trabalhou-se no sentido de melhorar estes parâmetros, desenvolvendo sensores LSPR em Fibra Ótica (OF, do inglês Optical Fibre) numa configuração em reflexão. Para atingir este objetivo as seguintes tarefas foram contempladas: síntese de Nanopartículas de Ouro (AuNPs, do inglês Gold Nanoparticles) de 3 tamanhos diferentes (20, 40, e 80 nm); análise morfológica e de estabilidade das NPs; produção das sondas em OF com 600 μm de diâmetro; comparação de dois silanos para ligação das AuNPs à OF (APTES vs MPTMS). Adicionalmente efetuaram-se testes de repetibilidade, reprodutibilidade e caracterização das sondas, avaliando o seu espetro de absorvância em função do Índice de Refração (RI, do inglês Refractive Index). Por fim a abordagem OF-LSPR com melhor sensibilidade e reprodutibilidade foi biofuncionalizada com anticorpos de forma a testar o desempenho destas sondas como biossensores. De um modo geral, os resultados mostraram que as sondas funcionalizadas com AuNPs de menor tamanho apresentam o melhor desempenho, atingindo uma sensibilidade média de 3,96±0,32 Arb.u./R.I.u., na mais ampla gama de respostas consistentes 1,3342-1,3356 R.I.u.. A repetibilidade e reprodutibilidade foram avaliadas estatisticamente recorrendo ao Coeficiente de Correlação Intraclasse 3 (ICC3, do inglês Intraclass Correlation Coefficient 3) resultando em valores de ICC3 ≥ 0,98 para ambas as figuras de mérito. Estes resultados suportaram a viabilidade desta abordagem que combina as vantagens dos fenómenos LSPR com a versatilidade da configuração em reflexão da OF. Posteriormente, um teste-piloto de imunoensaio da Albumina Sérica Humana (HSA, do inglês Human Serum Albumin) demonstrou que o biossensor desenvolvido identifica concentrações do analito numa gama operacional de 0,001-10 ng/mL, com uma sensibilidade média de (10,5±1,9)× 10⁻⁴ Arb.u./log(ng/mL). Esta investigação corrobora e expande a literatura existente, estabelecendo as fundações para avanços metodológicos na biodeteção por LSPR. A versatilidade inerente e o custo acessível do imunossensor desenvolvido, combinados com a sua idoneidade para a monitorização direta e em tempo real de interações moleculares em amostras de baixo volume, posiciona-o para futura integração em aplicações de biodeteção no ponto de interesse.

Mestrado em Engenharia Biomédica