Cápsides virales como vacunas contra el virus de la Fiebre Aftosa. Selección, potenciación y estudio de la respuesta inmune inducida

Tesis presentada para optar al título de Doctor en el área de Química Biológica, de la Universidad de Buenos Aires, en junio de 2022

La Fiebre Aftosa (FA) es una enfermedad infectocontagiosa aguda, causada por el Virus de la Fiebre Aftosa (VFA). La enfermedad afecta a bovinos, ovinos, cerdos y varias especies silvestres, se caracteriza por la aparición de fiebre y lesiones vesiculares localizadas en la cavidad bucal, lengua y alrededor de las pezuñas. La OIE categorizó a la FA en el Grupo A de enfermedades de alto riesgo. Las consecuencias económicas de la infección se deben al deterioro físico y productivo más que a perdidas por mortalidad, pero para los países exportadores de animales y productos animales, como la Argentina, las pérdidas de mayor importancia se deben a las fuertes restricciones en el comercio internacional. El control de la FA en áreas endémicas se realiza por vacunaciones periódicas con vacunas a virus inactivado. La vacuna inactivada ha demostrado ser eficaces en el control y erradicación de la enfermedad, pero implica costosas medidas de bioseguridad para su producción debido a las grandes cantidades de virus que se deben manipular, lo que conlleva el constante riesgo de escape viral. El mejoramiento en la producción de vacunas contra el VFA implica el desarrollo de alternativas recombinantes que superen estas desventajas manteniendo la inmunogenicidad de la vacuna actual. Por este motivo la producción de cápsides virales vacías recombinantes del VFA (CVVs) es una estrategia promisoria. La utilización de antígenos (Ags) no replicativos puede necesitar su combinación con adyuvantes que potencien su inmunogenicidad. Esta tesis evaluó el uso de Galectina 8 (Gal8) e Inmunostimulant Particle (ISPA), un nuevo tipo de Complejo Inmunoestimulante (ISCOM) de fabricación nacional, como adyuvantes. Las galectinas constituyen una familia de lectinas solubles con alta afinidad a β-galactósidos, las cuales a través de su unión a glicoreceptores de la superficie celular inducen proliferación, diferenciación, migración y secreción de citoquinas. EL ISPA, un nuevo tipo de ISCOM, consiste en partículas tipo “jaula de lípidos” conformada por dipalmitoil-fosfatidilcolina, colesterol, esterilamina, -tocoferol y la saponina Quil-A. Estos adyuvantes son capaces de desarrollar una respuesta inmune equilibrada Th1/Th2 y aumentar la respuesta citotóxica. El objetivo del presente trabajo de tesis fue evaluar y potenciar la capacidad inmunogénica y protectora de CVVs como vacunas contra el VFA tanto en un modelo murino como en bovinos. Primeramente, se evaluó la capacidad de aumentar la inmunogenicidad de los adyuvantes experimentales. Para ello se evaluaron formulaciones que contenían VFA inactivado (VFAi) junto a Gal8 o ISPA en el modelo murino. La formulación VFAi-Gal8 logró elevar el título de anticuerpos (Acs) comparado con VFAi solo. Además, VFAi-Gal8 indujo títulos de IgG2a e IgG2b mayores que la vacuna VFAi. Aunque se observó un aumento en la respuesta humoral inducida por la vacuna VFAi-Gal8, no se observó un aumento en la protección frente al desafío viral en ratones. En lo concerniente al ISPA, se observó que la formulación VFAi-ISPA indujo un aumento de la protección frente el desafío viral y en la respuesta humoral, caracterizada por un perfil equilibrado Th1/Th2, comparado con la vacuna VFAi solo, en el modelo murino. Se detectó una mayor proliferación de esplenocitos en el grupo VFAi-ISPA respecto a VFAi, y similar al grupo vacuna comercial. Y un aumento de CD4+/IFN+ y CD8+/IFN+ en el grupo VFAi-ISPA y vacuna comercial comparado a VFAi. En bovinos, los títulos de Acs alcanzados correspondieron a una Expectativa Porcentual de Protección (EPP) superior al 80%. La EPP se determina consultando tablas predeterminadas de correlación entre títulos de Acs anti-VFA y protección frente al desafío viral luego de la vacunación (Maradei et al., 2008; OIE - World Organisation for Animal Health, 2012; Senasa, 2017)Además, en comparación con la vacuna VFAi, VFAi-ISPA indujo una mayor respuesta específica de LT, incluido un aumento de CD8+/IFN+ en bovinos. En un esfuerzo por desarrollar nuevas vacunas que no involucren VFA infectivo se utilizaron CVVs del VFA cepa A/Argentina/2001 (A2001) recombinantes, expresada en células de mamíferos 293-6E, producidas por la Dra. Mignaqui, para formular las vacunas (Mignaqui et al., 2013, 2020). Primeramente, se evaluó la inducción de respuesta inmunitaria contra el VFA en ratones. Las vacunas CVVs-ISPA y CVVs-ISA206 indujeron una protección contra el desafío viral en el 100% de los ratones, mientras que la protección inducida por CVVs sola fue del 40%. Los Acs totales y neutralizantes contra el VFA fueron mayores en los grupos CVVs-ISPA y CVVs-ISA206 en comparación con el grupo CVVs. CVVs-ISPA indujo títulos de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 significativamente más altos que la vacuna CVVs. Además, CVVs-ISPA y CVVs-ISA206 provocaron una mayor respuesta T específica contra el virus, y un aumento de CD8+/IFN+ en ratones, comparado con el grupo CVVs. Cuando estas vacunas se probaron en bovinos, los títulos de Acs alcanzaron una EPP superior al 90% en el caso de las vacunas CVVs-ISPA y CVVs-ISA206, mientras que, en el grupo de CVVs, el EPP alcanzó el 25%. Los niveles de IFNγ secretados por las células mononucleares provenientes de los bovinos vacunados con CVVs-ISPA fueron significativamente mayores que en el grupo CVVs. En este trabajo de tesis se utilizaron cápsides virales vacías para la formulación de vacunas contra la FA. Los mismos han demostrado inducir protección humoral y celular en el modelo murino y en bovinos. La utilización de CVVs recombinantes expresadas en células de mamífero es un enfoque promisorio como alternativa a la vacuna convencional contra la FA, ya que no son infecciosos y pueden producirse sin necesidad de instalaciones de alta contención. Por ello, una nueva formulación que utilice CVVs recombinantes y un adyuvante de bajo costo que pueda fabricarse localmente son una buena alternativa a la vacuna comercial que se emplea actualmente.

Foot and Mouth Disease (FMD) is an acute infectious disease caused by the Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). The disease affects cattle, sheep, pigs, and several wild species. It is characterised by the appearance of fever and vesicular lesions localised in the oral cavity, tongue, and around the hooves. The OIE categorised FMD as a Group A high risk disease. The economic consequences of the infection are due to physical and productive decline rather than mortality losses, but for countries which export animals and animal products, such as Argentina, the most important losses are related to the severe restrictions to international trade. FMD control in endemic regions is done by periodic vaccinations with inactivated virus vaccines. These vaccines have demonstrated success in controlling and eradicating the disease but requires expensive biosecurity measures for its production due to the large virus amounts that need to be manipulated, which implies a constant risk of viral escape. The improvement of FMDV vaccine production involves the development of recombinant alternatives that overcome these disadvantages and maintain the current vaccine's immunogenicity. For this reason, the production of FMDV recombinant Virus-like Particles (VLPs) is a promising strategy. The use of non-replicative antigens requires the use of adjuvants to enhance their immunogenicity. This thesis evaluated Galectin 8 (Gal8) and Immunostimulant Particle (ISPA), a new type of Immunostimulatory Complex (ISCOM) domestically manufactured, as adjuvants. Galectins are a family of soluble lectins with high affinity to β-galactosides, which induce proliferation, differentiation, migration, and cytokine secretion by binding to cell surface glycoreceptors. ISPA, a new type of ISCOM, is a "lipid cage " type particle consisting of dipalmitoyl-phosphatidylcholine, cholesterol, sterylamine, -tocopherol and the saponin QuilA. These adjuvants can develop a balanced Th1/Th2 immune response and enhance the cytotoxic response. The aim of this thesis was to enhance the immunogenic and protective capacity of VLPs and to evaluate them as vaccines against FMDV in a murine model and in cattle. First, the immunogenicity-enhancing capacity of the experimental adjuvants was evaluated. For this purpose, formulations containing inactivated-FMDV (iFMDV) together with Gal8 or ISPA were evaluated employing the murine model. The iFMDV-Gal8 formulation increased the antibody (Ab) titre compared to iFMDV alone. In addition, iFMDV-Gal8 induced higher IgG2a and IgG2b titres than iFMDV vaccine. Although an increase in the humoral response was induced by iFMDV-Gal8 vaccine there wasn’t a corresponding increase in protection against viral challenge. Conversely, iFMDV-ISPA formulation induced an increase in protection against viral challenge and in the humoral response, characterized by a balanced Th1/Th2 profile, compared to the iFMDV vaccine alone. Furthermore, an increase in splenocyte proliferation was also demonstrated in iFMDV-ISPA group as compared to iFMDV, and a comparable response to the group immunized with the commercial vaccine. An expansion in CD4+/IFN + and CD8+/IFN + cells was detected in iFMDV-ISPA and in the commercial vaccine group compared to those treated only with iFMDV. In cattle, Abs titres achieved, corresponded to an Expected Percentage of Protection (EPP) above 80%. EPP was determined based on correlation tables between anti-VFA titres and protection against viral challenge after vaccination. Furthermore, compared to the iFMDV vaccine, iFMDV-ISPA induced a higher specific T-cell response, including an increase in CD8+/IFN+. In an effort to develop new vaccines avoiding the use of infectious FMDV, recombinant FMDV strain A/Argentina/2001 (A2001) were used to formulate the vaccines. Initially, the induction of an immune response against FMDV was evaluated in mice. VLPs-ISPA and VLPs-ISA206 vaccines induced protection against viral challenge in 100% of mice, whereas protection induced by VLPs alone was only 40%. Total and neutralizing Abs against FMDV were higher in the VLPs-ISPA and VLPs-ISA206 groups compared to the group inoculated only with VLPs. VLPs-ISPA vaccine induced significantly higher IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 titres than the VLPs vaccine. Moreover, in comparison to VLPs, VLPs-ISPA and VLPs-ISA206 elicited an amplified virusspecific T response, including higher number of CD8+/IFN+lymphocyte. When these vaccines were tested in calves, Abs titres reached an EPP above 90% for VLPs-ISPA and VLPs-ISA206 vaccines, while in the VLPs group EPP reached only 25%. When evaluating the cellular immune response, it was observed that the levels of IFN secreted by mononuclear cells from VLP-ISPA vaccinated cattle were significantly higher than in the VLP group. In this thesis non-infectious particulate immunogens were used to formulate vaccines against FMD. These have been shown to induce humoral and cellular immune response and a corresponding protection in the murine model and in cattle, the natural host of FMDV. The results presented in this thesis propose a vaccine formulated with FMDV recombinant VLPs as a valid and comparable alternative to the commercial vaccine currently used for FMDV control. VLPs expressed in mammalian cells offer a promising approach to the conventional production of FMD vaccine because they are non-infectious and can be produced without the need for high-containment facilities. Therefore, a new formulation using recombinant VLPs, and a lowcost adjuvant produced domestically is a good alternative to the commercial vaccine.

Instituto de Virología

Fil: Bidart, Juan Esteban. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas; Argentina

Fil: Bidart, Juan Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina