Caracterização biológica, morfológica e molecular de sarcocystis sp. Isolado de didelphis sp. no nordeste do Brasil | Biological, morphological and molecular characterization of Sarcocystis sp. isolated from Didelphis sp. in the Northeast of Brazil

TAVARES, ALINE S., Biological, morphological and molecular characterization of Sarcocystis sp. isolated from Didelphis sp. in the Northeast of Brazil. Salvador, Bahia, 2021. 95p. Thesis (Doctorate in Animal Science in the Tropics) - School of Veterinary Medicine and Animal Science - Federal University of Bahia, 2021. The present study aimed to in vitro isolate Sarcocystis spp. from Brazilian opossums to genetically compare the obtained isolates with those species described in North America, to reproduce their life cycles and to characterize the parasitic stages. Budgerigars (Melopsittacus undulatus) and opossums were used in bioassays. Sarcocystis sp. sporocysts were obtained from an opossum’s carcass and used for in vitro isolation of the parasite in a permanent avian cell line (DF-1). The isolated strain was named Sarco-BA1 and DNA from the cultured parasite was used for PCR and multilocus sequencing. Bioassay in nine budgerigars were conducted by oral inoculation of sporocysts and subcutaneous injection of merozoites. In the molecular analysis, the nucleotide sequence of the internal transcript 1 (ITS-1) of the rDNA was identical to ITS-1 sequences of the isolates (n = 19) of Sarcocystis spp. reported in two studies conducted in the south and southeast regions of the country. Two budgerigars that were orally inoculated with sporocysts (10 and 1000) developed acute sarcocystosis, showing that Sarco-BA1 is pathogenic for the employed bird species. Sequences of ITS-1 and for genes coding for three surface antigens (SAG2, SAG3 and SAG4) were almost identical to 16 isolates of S. falcatula-like described in Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) rescued on the coast of Espírito Santo state, Brazil. These findings suggest that Sarco-BA1 and S. falcatula-like represent a single species of Sarcocystis. In order to produce S. falcatula-like tissue cysts for morphological evaluation, budgerigars were inoculated with different doses of sporocysts that had been stored for approximately 12 months at 4°C. However, no cysts or signs of infection were observed in the inoculated animals, what is highly suggestive that sporocysts had lost their infectivity. Morphological analysis of merozoites and sporocysts were conducted by transmission electron microscopy (TEM). Ultrastructural details observed in the two studied parasitic stages were the same as described for Sarcocystis neurona and S. falcatula. The sporocysts examined by TEM showed degenerated sporozoites, as well as detachment of their outer wall. xi These findings strengths the suspicion that the prolonged storage of sporocysts led to the loss of their infectivity. The current work is the first in vitro isolation, morphological, biological and genetic analysis of S. falcatula-like from northeastern Brazil. Genetic data obtained here indicate that Brazilian isolates of S. falcatula-like possess similar genetic characteristics, i.e., high level of homology ITS-1 and high degree of variation for the genes that code for surface antigens (SAG); in contrast, Brazilian isolates of S. falcatula-like have significant genetic differences when compared to North American isolates of S. falcatula and S. neurona, as well as to other species of Sarcocystis identified in the Americas.

TAVARES, ALINE S., Caracterização biológica, morfológica e molecular de Sarcocystis sp. isolado de Didelphis sp. no ordeste do Brasil. Salvador, Bahia, 2021. 95p. Tese (Doutorado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Federal da Bahia, 2021. O presente estudo teve como objetivos isolar in vitro Sarcocystis spp. oriundos de gambás no Brasil, comparar os isolados obtidos com as espécies classificadas na América do Norte, reproduzir o ciclo de vida, e caracterizar os estágios parasitários. Foram utilizados gambás do gênero Didelphis e periquitos australianos (Melopsittacus undulatus). Esporocistos de Sarcocystis sp. obtidos de uma carcaça de gambá foram processados para o isolamento in vitro e se multiplicaram em uma linhagem celular permanente oriunda de aves (DF-1). A cepa obtida foi denominada de Sarco-BA1. DNA foi extraído do parasito e empregado em PCR e sequenciamento multilocus. Bioensaio em nove periquitos australianos foi conduzido mediante inoculação oral de esporocistos e inoculação subcutânea de merozoítos. Na análise molecular a sequência de nucleotídeos do espaço interno transcrito 1 (ITS-1) do rDNA foi idêntica à sequência dos isolados (n=19) de Sarcocystis spp. relatados em dois estudos das regiões sul e sudeste do país. Dois periquitos inoculados oralmente com esporocistos (10 e 1000) desenvolveram sarcocistose aguda, mostrando que Sarco-BA1 é patogênico para as aves empregadas no bioensaio. As sequências de ITS-1 e de genes codificadores para três antígenos de superfície (SAG2, SAG3 e SAG4) foram quase idênticas a 16 isolados de S. falcatula-like descritos em pinguins de Magalhães (Spheniscus magellanicus) resgatados na costa do estado do Espírito Santo, Brasil. Estes achados sugerem que Sarco-BA1 e S. falcatula-like representam uma única espécie de Sarcocystis. Foi realizada avaliação morfológica de merozoítos e esporocistos de S. falcatula-like por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os detalhes ultraestruturais observados nos dois estágios parasitários são semelhantes aos identificados em Sarcocystis neurona e S. falcatula. Os esporocistos observados na MET apresentaram esporozoítos degenerados, assim como descolamento de parte da parede externa dos esporocistos, o que reforça a suspeita de que os esporocistos, após período longo de conservação, perderam a sua infectividade. O trabalho corrente corresponde ao primeiro isolamento in vitro, ix avaliação morfológica, biológica e molecular de S. falcatula-like oriundo do nordeste e do Brasil. Os dados genéticos obtidos apontam que isolados de S. falcatula-like do Brasil possuem características genéticas comuns, ou seja, ITS-1 quase idênticos e elevado grau de variação nos genes codificadores para antígenos de superfície (SAG); em contraste, possuem diferenças genéticas significativas quando comparados a S. falcatula e S. neurona na América do Norte, assim como das demais espécies de Sarcocystis identificadas nas Américas.