Isolation and characterization of foodborne pathogen-infecting phages and genetic determinants of phage susceptibility in Staphylococcus aureus | Isolamento e caracterização de fagos que infectam patógenos alimentares e determinantes genéticos da susceptibilidade fágica em Staphylococcus aureus

The growing prevalence of antibiotic-resistant bacterial pathogens in clinical, veterinary, and food production settings demands alternative control strategies. Bacteriophages (phages), due to their host specificity and safety, have emerged as promising antimicrobial agents for both therapeutic and biocontrol applications. This thesis explores the isolation, genomic and functional characterization, and application of lytic phages targeting Salmonella enterica and Staphylococcus aureus, two major foodborne and zoonotic pathogens. The study also investigates bacterial genetic determinants that modulate susceptibility to phage infection. In Chapter 1, the polyvalent Tequintavirus phage UFVCit2 was isolated and shown to infect Citrobacter freundii, Shigella flexneri, and different S. enterica serovars. Genomic analysis confirmed its strictly lytic nature and genetic safety. UFVCit2 significantly reduced S. enterica counts on chicken meat and lettuce in food model experiments, highlighting its potential for biocontrol applications in complex matrices. Chapter 2 presents the characterization of phage CapO46, a newly identified Rosenblumvirus with broad activity against S. aureus strains from clinical and environmental origins. CapO46 exhibited rapid adsorption kinetics, a short latent period, and stable lytic activity in ultra-high-temperature (UHT) milk, achieving up to 7.2 log10 CFU/mL reduction after 12 hours. Genomic analyses confirmed the absence of lysogeny, virulence, or resistance genes, further supporting its suitability as a safe and effective biocontrol agent for dairy applications. In Chapter 3, a genome-wide CRISPR interference (CRISPRi-seq) screen was conducted to identify host factors in S. aureus that influence susceptibility to CapO46. The screen revealed that repression of mgrA, sarZ, and SAOUHSC_00695 conferred resistance to infection, while silencing rpiRc increased susceptibility. Functional validation via bacterial growth, phage replication, adhesion, and biofilm formation assays confirmed the involvement of these genes in regulating both phage sensitivity and surface-associated virulence traits. Altogether, this work demonstrates the potential of phages as targeted, safe, and sustainable alternatives to antibiotics, and underscores the importance of genetic context in modulating bacterial susceptibility. The integration of phage genomics, food model applications, and functional bacterial genetics provides a comprehensive framework for the rational development ofphage-based biocontrol and therapeutic strategies. Keywords: Salmonella enterica; Staphylococcus aureus; Biocontrol; CRISPR interference; Host factors; Phage resistance.

A crescente prevalência de patógenos bacterianos resistentes a antibióticos em contextos clínico, veterinário e de produção de alimentos exige estratégias de controle alternativas. Os bacteriófagos (fagos), devido à sua especificidade de hospedeiro e segurança, surgem como agentes antimicrobianos promissores tanto para aplicações terapêuticas quanto de biocontrole. Esta tese aborda o isolamento, caracterização genômica e funcional, e aplicação de fagos líticos direcionados a Salmonella enterica e Staphylococcus aureus, dois importantes patógenos de origem alimentar e zoonótica. O estudo também investiga determinantes genéticos bacterianos que modulam a susceptibilidade à infecção fágica. No Capítulo 1, foi isolado o fago polivalente UFVCit2, pertencente ao gênero Tequintavirus, com atividade lítica contra Citrobacter freundii, Shigella flexneri e diferentes sorovares de S. enterica. A análise genômica confirmou sua natureza estritamente lítica e perfil genético seguro. Em experimentos com modelos alimentares, UFVCit2 reduziu significativamente as contagens de S. enterica em carne de frango e alface, destacando seu potencial como agente de biocontrole em matrizes complexas. O Capítulo 2 apresenta a caracterização do fago CapO46, um Rosenblumvirus recém- identificado com ampla atividade contra cepas de S. aureus de origens clínicas e ambientais. CapO46 demonstrou cinética de adsorção rápida, curto período de latência e atividade lítica em leite UHT, alcançando até 7,2 log10 CFU/mL de redução após 12 horas. As análises genômicas confirmaram a ausência de genes relacionados à lisogenia, virulência ou resistência, reforçando sua adequação como agente seguro e eficaz para aplicações em produtos lácteos. No Capítulo 3, foi realizada uma triagem genômica por CRISPR de interference (CRISPRi-seq) para identificar fatores do hospedeiro em S. aureus que influenciam a susceptibilidade ao fago CapO46. A triagem revelou que a repressão dos genes mgrA, sarZ e SAOUHSC_00695 conferiu resistência à infecção, enquanto o silenciamento de rpiRc aumentou a susceptibilidade. A validação funcional por meio de ensaios de crescimento bacteriano, replicação fágica, adesão e formação de biofilme confirmou o envolvimento desses genes na regulação da sensibilidade ao fago e em características associadas à virulência superficial. Em conjunto, este trabalho demonstra o potencial dos fagos como alternativas direcionadas, seguras e sustentáveis aos antibióticos, e destaca a importância do contexto genético na modulação da susceptibilidade bacteriana. A integração entre genômica de fagos, testes em modelos alimentares e genética funcional bacteriana fornece uma base abrangente para o desenvolvimento racional de estratégias terapêuticas e de biocontrole baseadas em fagos. Palavras-chave: Salmonella entérica; Staphylococcus aureus; Biocontrole; Interferência por CRISPR; Fatores do hospedeiro; Resistência a fagos.

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