Study of Chorion Malformations in Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos Based on Biomarker Evaluation of Nutritional, Ultrastructural, and Molecular Aspects

Chile es el segundo mayor productor de salmón en el mundo, con la salmonicultura representando el 52,1% de la acuicultura del país. La producción de salmónidos está representada por el salmón del Atlántico con un 71% del total y 67,5% de la producción de embriones, seguido por el salmón coho (21,4%) y la trucha arcoíris (11,1%). Uno de los mayores desafíos en la producción de embriones es la calidad de los oocitos y embriones y, por tanto, su sobreviviencia. Diferentes factores pueden influir en la calidad de los oocitos incluyendo el manejo de los reproductores, los niveles de estrés y la nutrición. Los oocitos de peces están rodeados por una envoltura acelular, el corion, que protege al embrión hasta la eclosión, por tanto, malformaciones del corion podrían afectar la sobrevivencia embrionaria. Se evaluó la eficiencia reproductiva, la viabilidad embrionaria y las malformaciones del corion en el salmón Atlántico mediante el estudio del efecto del cambio de dieta de los reproductores durante la maduración gonadal y el análisis ultraestructural y molecular del corion. Cuatro dietas fueron comparadas: La dieta 1 contenía exclusivamente proteínas e ingredientes lipídicos de origen marino, la dieta 2 consistía en sustituir el 65% de las proteínas y el 51% de los lípidos por fuentes animales y vegetales terrestres, y las dietas 3 y 4 eran dietas comerciales. Los resultados indicaron que las dietas 1 y 2 presentaron un mayor porcentaje de hembras desovadas (73,3% y 66,7%, respectivamente) comparadas con las dietas comerciales (53,3% y 50%). La hidratación de los oocitos fue estadísticamente diferente entre las dietas 2 y 3. La dieta 3 presentó una correlación negativa entre los niveles de hidratación y la ocurrencia de microftalmia. La simetría de los blastómeros y sobrevivencia a las 280 unidades térmicas acumuladas mostró diferencia estadística entre las dietas 3 y 4. Las malformaciones del corion, incluyendo corion blando (más prevalente), con disco y perforado, fueron observados a través de las dietas, con una mayor cantidad de hembras presentando embriones con corion blando en la dieta 1 (40%). La mortalidad fue significativamente mayor en embriones con corion blando (34,17%) comparado con el corion perforado (6,20%). El análisis por microscopía electrónica de barrido reveló claras diferencias estructurales del corion con malformaciones respecto al corion normal, una vez que este último presentaba una capa externa con una textura granular, dado la presencia de tapones en la superficie, mientras que la capa interna estaba formada por fibras interconectadas formando una red con numerosos canales porosos. Por otro lado, las regiones del corion con malformación, la arquitectura de fibras y poros estaba alterada o no presente, especialmente en el corion con disco y perforado. Generalmente, el corion blando parecía no tener cambios estructurales de las capas, especialmente en los casos que no se reventaba fácilmente con la manipulación. La implementación del protocolo de SDS-PAGE para la identificación de las proteínas del corion normal permitió la identificación de más de cuatro bandas de proteínas (25-180 kDa). Para la extracción de proteínas se usó la solución SDS [Tris HCl 100 mM (pH 8), Urea 8 M, 1% SDS, β-mercaptoetanol 300 mM y EGTA 10 Mm, y cóctel inhibidor de proteasas al 1%] y métodos mecánicos. En conclusión, las dietas de origen marino mejoraron el rendimiento reproductivo de las hembras de salmón del Atlántico subrayando la necesidad de estrategias alimentarias sostenibles que mejoren la eficiencia reproductiva de las hembras y la viabilidad embrionaria. Aparentemente la presencia de malformaciones del corion pueda deberse más al individuo que a la dieta específica, sin embargo, también puede deberse al histórico nutricional de los reproductores antes de recibir las dietas en el experimento. Otros estudios sobre la expresión génica y los mecanismos moleculares podrían ayudar a aclarar la relación entre nutrición, integridad del corion y desarrollo embrionario, proporcionando resultados que contribuyan a mejorar la calidad de los gametos y embriones producidos por las piscifactorías, así como la sostenibilidad de la salmonicultura.

Chile is the world's second-largest salmon producer, with salmon farming contributing 52.1% of the country's aquaculture. Atlantic salmon dominates production, representing 71% of total salmonid output and 67.5% of embryo production, followed by coho salmon (21.4%) and rainbow trout (11.1%). One of the biggest challenges in embryo production is the quality of the oocytes and embryos and, therefore, their survival. Different factors can influence oocyte quality including broodstock management, stress levels and nutrition. Oocytes are surrounded by acellular evelope, the chorion, which protects the embryo until hatching, therefore, chorion malformations could negatively affect embryo survival. Reproductive efficiency, embryonic viability and chorion malformations in Atlantic salmon were evaluated by studying the effect of changing broodstock diets during gonadal maturation and the ultrastructural and molecular analysis of the chorion. Four diets were compared: diet 1 contained principally marine-origin protein and lipid ingredients, diet 2 involved substituting 65% of the protein and 51% of the lipid by terrestrial animal and vegetable sources, diets 3 and 4 were commercial diets. The results indicated that diets 1 and 2 produced a higher percentage of spawning females (73.3% and 66.7%, respectively) compared to the commercial diets (53.3% and 50%). Oocyte hydration was statistically different between diets 2 and 3. Diet 3 showing a negative correlation between hydration levels and the occurrence of microphthalmia. Blastomere symmetry and survival at 280 accumulated thermal units showed statistical differences between diets 3 and 4. Chorion malformations, including soft chorion (most prevalent), disc chorion, and perforated chorion, were observed across diets, with the highest rates of soft chorion malformations in diet 1 (40%). Mortality was significantly higher in embryos with soft chorion (34.17%) compared to those with perforated chorion (6.20%). Scanning electron microscopy analysis revealed clear structural differences between the malformed chorion and the normal chorion, as the latter had an outer layer with a granular texture, due to the presence of plugs on the surface, while the inner layer consisted of interconnected fibres forming a network with numerous pore channels. On the other hand, in the malformed regions of the chorion, the fibre and pore architecture were altered or absent, especially in the disc and perforated chorion. Generally, soft chorion appeared to have no structural changes of the layers, especially in cases that did not burst easily with manipulation. Protocol implementation of SDS-PAGE for the identification of normal chorion proteins allowed the identification of more than four protein bands (25-180 kDa). SDS solution [100 mM Tris HCl (pH 8), 8 M Urea, 1% SDS, 300 mM β-mercaptoethanol and 10 Mm EGTA, and 1% protease inhibitor cocktail] and mechanical methods were used for protein extraction. In conclusion, diets of marine origin improved reproductive performance of female Atlantic salmon underlining the need for sustainable feeding strategies that improve female reproductive efficiency and embryonic viability. It appears that the presence of chorion malformations may be due more to the individual than to the specific diet, however, it may also be due to the nutritional history of the broodstock before receiving the diets in the experiment. Further studies on gene expression and molecular mechanisms could help to clarify the relationship between nutrition, chorion integrity and embryonic development, providing results that contribute to improving the quality of gametes and embryos produced by the farms as well as the sustainability of salmon farming.