Development of multiplex PCR system for identification of glyphosate-tolerant sugar beet | Создание мультиплексной системы ПЦР для идентификации сахарной свеклы, толерантной к воздействию глифосата | Розроблення мультиплексної системи ПЛР для ідентифікації цукрових буряків, толерантних до дії гліфосату

Английский. Purpose. To create a multiplex system for identification glyphosate-tolerant sugar beet by using PCR. Methods. Molecular genetic analysis. Results. The article presents the results of studies to determine the parameters of the polymerase chain reaction (PCR) in order to develop a multiplex system for identification of the structural elements of the design of transgenic gene cp 4 epsps, which provides tole­rance to glyphosate. For amplicon target DNA sequences, the following values of temperature conditions of PCR were determined: step 1 (initial denaturation) 95 °C – 3 min; step 2 (specific reaction products accumulation): denaturation 95 °C – 45 s; hybridization of primers 55 °C – 50 s; elongation 72 °C – 1 min; number of cycles – 40; step 3 (final elongation) 72 °C – 6 min. A series of PCR were carried out for the purpose of selecting the optimal amount of DNA matrix for efficient estimate of transgenic sugar beet plants for the presence of specific sequences. Conclusions. To identify transgenic glyphosate-tolerant sugar beet, it is advisable to determine 35S promoter and gene cp 4 epsps in individual genotypes. It was found that during the selection of temperature parameters of multiplex reaction a 5 °C rise in primer hybridization temperature did not affect the identification of gene als that allowed to include specific primers for determination of this sequence as an internal control. Based on the results of test multiplex reactions, concentrations of dNTPs and Mg2+ ions were determined that allowed to exclude the possibility of non-specific fragments and false-negative results. The optimum amount of matrix DNA (100–150 ng) for an efficient estimate of transgenic sugar beet plants for the presence of specific sequences was determined. Obtained results allowed to develop a multiplex test system for identification of transgenic glyphosate-to­lerant sugar beet which can be used for simultaneous determination of the 35S promoter, cp 4 epsps gene and als gene as an internal reaction control.

Русский. Цель. Создать мультиплексную систему для идентификации толерантной к глифосату сахарной свеклы с помощью ПЦР. Методы. Молекулярно-генетические методы анализа нуклеиновых кислот. Результаты. Приведены результаты исследований по определению параметров полимеразной цепной реакции (ПЦР) для разработки мультиплексной системы по идентификации структурных элементов трансгенной конструкции с геном сp 4 epsps, что обеспечивает толерантность к глифосату. Для получения ампликонов целевых последовательностей ДНК определены следующие значения температурных режимов ПЦР: шаг 1 (начальная денатурация) 95 °С – 3 мин; шаг 2 (наработка специфических продуктов реакции): денатурация 95 °С – 45 с; гибридизация праймеров 55 °С – 50 с; элонгация 72 °С – 1 мин; количество циклов – 40; шаг 3 (конечная элонгация) 72 °С – 6 мин. Проведена серия ПЦР с целью подбора оптимального количества матрицы ДНК для эффективной оценки трансгенных растений сахарной свеклы по наличию специфических последовательностей. Выводы. Для идентификации трансгенной сахарной свеклы, толерантной к воздействию глифосата, целесообразно определять в отдельных генотипах 35S промотор и ген cp 4 epsps. Установлено, что при подборе температурных параметров мультиплексной реакции на идентификацию гена als не влияло увеличение температуры гибридизации праймеров на 5 °С, что позволило включить специфические праймеры для определения этой последовательности в качестве внутреннего конт­роля. По результатам пробных мультиплексных реакций определены концентрации дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов) и ионов Mg2+, которые позволили исключить возможность получения неспецифических фрагментов и ложноотрицательных результатов. Определено оптимальное количество матрицы ДНК (100–150 нг) для эффективной оценки трансгенных растений сахарной свек­лы по наличию специфических последовательностей. Полученные результаты позволили разработать мультиплексную тест-систему для идентификации трансгенной сахарной свеклы, толерантной к воздействию глифосата, с помощью которой можно одновременно определить 35S промотор, ген cp 4 epsps и ген als в качестве внутреннего контроля реакции.

украинский. Мета. Створити мультиплексну систему для ідентифікації толерантних до гліфосату буряків за допомогою ПЛР. Методи. Молекулярно-генетичні методи аналізу нуклеїнових кислот. Результати. Наведено результати досліджень з визначення параметрів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для розроблення мультиплексної системи для ідентифікації структурних елементів трансгенної конструкції з геном cp 4 epsps, що забезпечує толерантність до гліфосату. Для отримання ампліконів цільових послідовностей ДНК визначено такі значення температурних режимів ПЛР: крок 1 (початкова денатурація) 95 °С – 3 хв; крок 2 (напрацювання специфічних продуктів реакції): денатурація 95 °С – 45 с; гібридизація праймерів 55 °С – 50 с; елонгація 72 °С – 1 хв; кількість циклів – 40; крок 3 (кінцева елонгація) 72 °С – 6 хв. Проведено серію ПЛР з метою добору оптимальної кількості матриці ДНК для ефективної оцінки транс­генних рослин цукрових буряків за наявністю специфічних послідовностей. Висновки. Для ідентифікації трансгенних цук­рових буряків, толерантних до дії гліфосату, доцільно визначати в окремих генотипах 35S промотор та ген cp 4 epsps. Встановлено, що в процесі добору температурних параметрів мультиплексної реакції на ідентифікацію гена als не впливало збільшення температури гібридизації праймерів на 5 °С, що дало змогу включити специфічні праймери для визначення цієї послідовності як внутрішнього контролю. За результатами пробних мультиплексних реакцій визначено концентрації дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатів) та іонів Mg2+, які дали змогу виключити можливість отримання неспецифічних фрагментів та хибно негативних результатів. Визначено оптимальну кількість матриці ДНК (100–150 нг) для ефективної оцінки трансгенних рослин цукрових буряків за наявністю специфічних послідовностей. Отримані результати дали змогу розробити мультиплексну тест-систему для ідентифікації трансгенних цукрових буряків, толерантних до дії гліфосату, за допомогою якої можна одночасно визначити 35S промотор, ген cp 4 epsps та ген als як внутрішній контроль реакції.