Detecção de peptídeos de proteína hipotética de Leptospira interrogans e sua utilização na geração de anticorpos e em plataforma de diagnóstico sorológico | Detection of Leptospira interrogans hypothetic protein peptide and its use in the generation of antibodies and sorological diagnosis platform

Pathogenic leptospiras are recognized as causative agents of leptospirosis, a re-emergent infectious disease and one of the most prevalent zoonosis worldwide, especially in tropical climates, such as Brazil. In the first chapter of this thesis, general considerations about the bacteria and the use of bioinformatics tools and IgY antibodies against leptospirosis were presented. In the second chapter, the aim was to identify in silico protein targets with potential application in the diagnosis of leptospirosis and development of vaccines, using reverse vaccinology techniques. We compared 80 strains of Leptospira interrogans using Leptospira interrogans serovar Lai as the reference genome. A total of 1096 conserved proteins absent in the hosts were identified, including 212 gene products predicted as putative surface-exposed proteins and 87 secreted proteins. We identified 37 proteins as promising candidates for the production of vaccines and as diagnostic markers. Sixteen of these proteins (43.2%) do not have a predicted family or domain by the InterProScan program. In the third chapter, we evaluated the development of IgY and IgG polyclonal antibodies from the inoculation of chickens and rabbits, respectively, with epitopes chemically synthesized and predicted from the hypothetical protein (AAN50190.1) of Leptospira interrogans. Three B cell epitopes (P127, P128 and P129) were selected. A total of 8.05 ± 0.55 mg / mL of total IgY antibodies extracted from the yolk were obtained. In the standardization of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the peptide with the highest humoral response induction was P127. The maximum titre obtained for yolk and serum IgY was 1,600 and 200, respectively, and for rabbits 800. In the indirect immunofluorescence (IFT) reaction, IgY antibodies (1:50) recognized leptospiras. In this study, the synthetic peptides of L. interrogans induced the production of specific IgY antibodies and were shown to be promising for use in ELISA and IFT platforms for the study of leptospirosis. In the fourth chapter, the aim was the standardization of an ELISA platform using synthetic peptides (ELISApeptide) of L. interrogans (P127, P128 and P129) for the diagnosis of bovine leptospirosis. P127 showed the best reactivity during the optimization and was selected for the standardization tests using bovine serum panels from two herds (RB1, n = 80, RB2, n = 100). The relative sensitivity and specificity (ELISA versus MAT) for RB1 and RB2 were 85% - 93% and 78% - 80%, respectively. The Kappa index for RB1 and RB2 were 78% (good) and 58% (regular), respectively. In this study, the synthetic peptides of the hypothetical protein of L. interrogans were recognized by serum IgG antibodies from bovines naturally exposed to the bacterium. The epitopes of L. interrogans hypothetical proteins predicted by immunoinformatic are promising for the development of specific biologicals, ELISA and IFT platforms, and are recognized by natural infection antibodies.

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais

Tese (Doutorado)

As leptospiras patogênicas são reconhecidas como agentes responsáveis pela leptospirose, uma doença infectocontagiosa, reemergente e uma das zoonoses de maior ocorrência em todo o mundo, principalmente em países com clima tropical, como o Brasil. No primeiro capítulo dessa Tese, foram apresentadas as considerações gerais sobre a bactéria e o uso de ferramentas de bioinformática e anticorpos IgY contra leptospirose. No segundo capítulo os objetivos foram a identificação in silico de alvos com potencial para aplicação no diagnóstico de leptospirose e também no desenvolvimento de vacinas. Foram comparados 80 genomas de Leptospira usando Leptospira interrogans sorovar Lai como referência. Foram detectados 1096 genes não homólogos a hospedeiros de Leptospira, dos quais foram preditas 212 proteínas putativas expostas na membrana e 87 antígenos secretados. Foram identificadas 37 proteínas como candidatas promissoras para a produção de tecnologias para diagnóstico e desenvolvimento de vacinas. Entre a proteínas de interesse preditas, 43,2% (16/37) ainda não possuem descrição de agrupamento em superfamílias ou famílias de proteínas. No terceiro capítulo, foi avaliado o desenvolvimento de anticorpos policlonais IgY e IgG a partir da inoculação de galinhas e coelhos, respectivamente, com epítopos quimicamente sintetizados e preditos a partir de uma proteína hipotética de L. interrogans. Foram selecionados três epítopos de células B (P127, P128 e P129). Foram obtidos 8,05 ± 0,55 mg/mL de anticorpos IgY totais extraídos da gema. Na padronização de plataforma de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), o peptídeo com maior indução de resposta humoral foi o P127. O título máximo obtido para IgY sérica e da gema foi 1.600 e 200, respectivamente, e para os coelhos 800. Na reação de imunofluorescência indireta (RIFI) os anticorpos IgY (1:50) reconheceram as Leptospira. Nessa pesquisa, os peptídeos sintéticos de L. interrogans induziram a produção de anticorpos IgY específicos e mostraram-se promissores para a sua utilização em plataformas ELISA e RIFI destinadas ao estudo da leptospirose. No quarto capítulo, o objetivo foi a padronização de uma plataforma ELISA com o uso dos peptídeos sintéticos (ELISAPeptídeo) de L. interrogans (P127, P128 e P129) para o diagnóstico da leptospirose bovina. P127 demonstrou a melhor reatividade na otimização e foi selecionado para os testes de padronização utilizando soros bovinos de dois rebanhos (RB1, n=80; RB2, n=100). A sensibilidade e a especificidade relativas (ELISA versus MAT), para RB1 e RB2 foram 85% - 93% e 78% - 80%, respectivamente. Os índices Kappa para RB1 e RB2 foram 78% (bom) e 58% (regular), respectivamente. Neste estudo, os peptídeos sintéticos de proteína hipotética de L. interrogans foram reconhecidos por anticorpos IgG séricos de bovinos naturalmente expostos à bactéria. Os epítopos de proteínas hipotéticas de L. interrogans preditos por meio de imunoinformática são promissores para o desenvolvimento de biológicos específicos, plataformas ELISA e RIFI, e são reconhecidos por anticorpos de infecção natural.

2023-03-08

2026-06-21