Sequential depolymerization of lignin from softwood biomass enabled by integrated protic ionic liquid-enzyme pretreatment

ABSTRACT. This doctoral thesis explores an innovative approach to sustainably valorize wood biomass. The research covers several stages: optimized lignin extraction, fractionation (separation into parts), enzymatic breakdown, and detailed structural analysis. In Paper I, the enzymatic breakdown of lignin obtained from an Estonian biorefinery was studied first. Results showed that lignin’s molecular weight (size of the molecule) and the presence of carbohydrate impurities significantly hinder enzymes from breaking it down larger lignin molecules and impurities make depolymerization more difficult. The breaking down of lignin into small molecule’s or depolymerization is important to make chemicals. Although, enzymes worked at fairly high lignin concentrations (up to 50 g/L) in an aqueous solution, they only cleaved bonds effectively at very low concentrations, highlighting the challenge posed by lignin’s complex structure. The knowledge from Papers I and II was then combined into a comprehensive lignin valorization process in Papers III and IV. A key advancement was using engineered bacterial enzymes (Obtained from METGEN Oy, Finland) called laccases to further break down the lignin extracted by the PIL solvent. The chosen protic ionic liquid enabled high lignin yield (70%) and efficient removal from biomass (87%), producing lignin with reduced molecular weight. Following lignin extraction, a subsequent fractionation separated lignin into two parts: a low molecular weight fraction with very little carbohydrate contamination (~2%) and a high molecular weight fraction with more impurities (~6%) was accomplished (Paper III). Afterwards, enzymatic treatment under alkaline conditions of lower molecular weight lignin modified the lignin structure significantly. NMR spectroscopy (including phenolic region analysis and HSQC correlation) quantified a 9.2% reduction in aliphatic hydroxyl groups and a 73.8% decrease in phenolic hydroxyl groups, indicating selective cleavage of lignin linkages. Crucially, the low molecular weight, low-carbohydrate fraction exhibited superior enzymatic susceptibility, directly demonstrating the inhibitory role of both molecular weight and carbohydrate impurities and validating the core hypothesis of this thesis (Paper IV). By demonstrating how optimized extraction and depolymerization can efficiently transform lignin into a renewable source of valuable chemicals, this work provides a scalable and sustainable pathway for lignin valorization.

LÜHIKOKKUVÕTE. Käesolev doktoritöö käsitleb innovaatilist lähenemist puidubiomassi jätkusuutlikuks väärindamiseks. Uuring hõlmab mitut etappi: optimeeritud ligniini eraldamist, fraktsioneerimist, ensümaatilist lagundamist ja põhjalikku struktuurianalüüsi. Esimeses artiklis (Paper I) uuriti esmalt ensümaatilist ligniini lagundamist Eesti biorefinerii poolt saadud ligniinist. Tulemused näitasid, et ligniini molekulmass ning süsivesikute saasteained takistavad ensüümide tööd märkimisväärselt suuremad molekulid ja lisandid raskendavad depolümerisatsiooni ehk ligniini väiksemateks molekulideks lagundamist, mis on oluline keemiatööstuse seisukohast. Kuigi ensüümid töötasid suhteliselt kõrgetel ligniini kontsentratsioonidel vesilahuses, lõhkusid nad sideaineid efektiivselt vaid väga madalatel kontsentratsioonidel, rõhutades ligniini keeruka struktuuri esitatud väljakutseid. Esimese ja teise artikli (Papers I ja II) teadmised integreeriti seejärel põhjalikku ligniini väärindamise protsessi Papers III ja IV raames. Oluliseks edusammuks oli inseneritud bakteriaalsete ensüümide lakkasaaside (saadud METGEN Oy, Soome) kasutamine ligniini edasiseks lagundamiseks, mis oli ekstraheeritud PIL lahusti abil. Valitud protroopne ioonvedelik võimaldas saavutada kõrget ligniini saagist (70%) ja efektiivset biomassist eemaldamist (87%), tootes madala molekulmassiga ligniini. Pärast ligniini ekstraheerimist viidi läbi fraktsioneerimine, mis eraldas ligniini kaheks fraktsiooniks: madala molekulmassiga fraktsioon, kus süsivesikute saaste oli väga madal, ning kõrge molekulmassiga fraktsioon, kus lisandeid oli rohkem (Paper III). Seejärel toimus ensümaatilne töötlemine aluselistel tingimustel madala molekulmassiga ligniini fraktsioonil, mis põhjustas ligniini struktuuri olulisi muutusi. NMR-spektroskoopia (sh fenoolsete piirkondade analüüs ja HSQC korrelatsioon) näitas alifaatsete hüdroksüülrühmade 9,2% ja fenoolsete hüdroksüülrühmade 73,8% vähenemist, mis viitab ligniini sidemete selektiivsele lõhustumisele. Eriti madala molekulmassiga ja vähese süsivesikute saastega fraktsioon oli ensüümide mõjule oluliselt vastuvõtlikum, mis kinnitab ligniini molekulmassi ja saasteainete pärssivat rolli ning toetab selle doktoritöö põhihüpoteesi (Paper IV). Kokkuvõttes näitab käesolev töö, kuidas optimeeritud ekstraheerimine ja depolümerisatsioon võimaldavad efektiivselt muuta ligniini taastuvaks väärtuslike kemikaalide allikaks, pakkudes skaleeritavat ja jätkusuutlikku ligniini väärindamise lahendust.