Détermination et suivi quantitatif de la structure d'une population virale complexe par la technique d'analyse discriminante de signatures clonales (DACS® : Discriminative Analysis of Clone Signature)

法语. Comment obtenir des informations quantitatives - sans l'hybridation moléculaire et sans la Q-PCR - sur la structure d'une population virale complexe (mélange de plusieurs clones, variants, ou souches) et son évolution ? Notre but était de pouvoir créer des marqueurs génétiques, puis de les identifier et de suivre leur fréquence relative dans une population virale complexe. Différents clones viraux du CaMV (Cauliflower mosaic virus) ont été construits. Chaque construction diffère par une cassette spécifique de 40 pb, insérée à une position identique dans le génome viral. Des solutions virales mixtes, comportant 5 à 6 clones viraux en proportion variable, ont été préparées et soit analysées directement, soit inoculées à des plantes hôtes. Pour l'analyse de ces différentes populations mixtes, nous avons mis en place une technique originale dérivée du DACS (technologie propriétaire développée par GENOME express). Cette technique consiste en un séquençage sur une seule lettre (par exemple A) des produits PCR correspondant à la région de l'ADN viral contenant les cassettes. Du fait de la faible homologie de séquence des cassettes, chaque clone viral possède alors une signature spécifique à ce niveau, avec présence ou absence de A à chaque position de nucléotide. Il existe donc sur l'électrophorégramme un ou plusieurs « pic(s) » spécifique(s) pour chacun de nos marqueurs (signature). Ainsi, nous pouvons très simplement déterminer, par la présence ou l'absence de ces pics spécifiques, la présence/absence de chacun des marqueurs et ainsi, la composition de populations virales complexes. L'obtention de données quantitatives s'effectue par une simple analyse complémentaire du même électrophorégramme. En effet, chaque pic spécifique à un marqueur donné aura une hauteur proportionnelle à la fréquence relative de ce marqueur dans la population. Nous pouvons ainsi, sur un simple produit de PCR amplifié à partir d'une population virale contenant plusieurs clones marqués, obtenir rapidement des informations fiables et reproductibles sur la présence/absence des marqueurs dans la population et sur leur fréquence relative. La mise au point de cette méthode sera présentée sur la base de l'étude des goulots d'étranglement que subissent les populations du CaMV lors de l'invasion de la plante hôte et lors de la transmission par pucerons vecteurs. Nous pensons que cette méthode d'analyse originale pourrait servir au suivi quantitatif de compétitions entre clones viraux de laboratoire (notre cas), ainsi qu'entre des variants ou des souches naturelles de séquence connue, voir même dans certains cas entre différentes espèces virales. Elle peut certainement aussi être appliquée à d'autres parasites et plus généralement à l'analyse populationnelle de divers microorganismes.