Proteinanalyse ved hjelp av massespektrometri

Hovedmålet med oppgaven var å teste ulike prosedyrer for fraksjonering av celler. Ved å identifisere og kvantifisere proteinuttrykk ved hjelp av LC-MS (væskekromatografi-massespektrometri) som metode kan man bestemme fraksjoneringseffektiviteten til hver enkelt fraksjonerings metode. Subcellulær fraksjonering av proteiner ble delt inn i membran-, cytosol-, cytoskjelett/mitokondrie- og cellekjernekomponent. Det ble brukt Tert celler, som er mesenchymale stamceller Proteinene i de ulike fraksjonene ble separert med hensyn på masse ved SDS-PAGE. Hver brønn i gelen for de individuelle subcellulære fraksjonene ble delt i ti og proteinene ble ekstrahert ut av gelen og hydrolysert ved hjelp av proteasen trypsin. Videre ble peptidene separert og analysert med væskekromatografi-elektrosprayioniserings-massespektrometri/massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).Peptidene fra hver fraksjon ble analysert med oppsett І (tabell 2). Oppsettet ga 361 proteintreff for det kommersielle fraksjoneringskitet ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction kit og 41 proteintreff for manuell fraksjoneringsmetode. Et delmål til oppgaven var å utvikle en metode for å kontrollere at seterettet mutagenese blir riktig utført. Kitinase B (ChiB) fra jordbakterien Serratia marcescens og mutanter av denne ble benyttet som modellproteiner. Det ble gjort tre forskjellige forsøk på å kontrollere at mutasjonen fant sted på riktig plass ved hjelp av Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, High Performance Liquid Chromatography (MALDI, HPLC) og kjemisk merking av mutantene. Innvirkning ulike matriksløsninger hadde på ioniseringen av mutantene ble undersøkt og viste at det var små forskjeller i hvor lett det var å identifisere mutantene med de forskjellige matriksene. Sinapinic acid mettet med Ta30 (30% ACN (100%),70% TFA (0,1%)) ble ansett å være bedre enn sinapinic acid mettet med ETOH. HPLC koblet med massespektrometri ble benyttet for å separere og detektere proteinene i prøvene. Hver av de syv trypsinerte proteinene ble analysert ved hjelp av LC-MS, og sekvensene for hver mutant ble satt inn i tabell 3-9. Vi har i våre innstillinger godtatt 1 feilkløyving (missed cleavage). Feilkløyving innbærer at trypsin, som er en spesifikk serinprotease, ikke kløyver ved alle R eller K i peptidet slik den skal, men ”hopper” over en aminosyre. Dette fører til flere mulige treff når man søker i databasen, og er årsaken til at tabellen inneholder mer enn en sekvens for hvert muterte peptid. Dette er en viktig innstilling da man ofte ser at trypsin ikke er 100 % effektiv. Det ble brukt to kjemisk derivatiserings metoder (SPITC og Lys-Tag) for trypsindegraderte proteiner etterfulgt av identifisering ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri. Lys-Tag legger til en endring i massen på +68 Da i ε-amino gruppen av lysin, og omdanner denne til imidazole ring. SPITC har en større forskyvning på +215 Da. Derivatisering ble utført på ChiB-W220A (figur 4.18 og 4.19), men resultatene var ikke som ønsket da vi ikke fikk den ønskede forskyvningen på +68 Da for Lys-Tag og heller ikke +215 Da for SPITC. The main goal with this master thesis is to test different procedures for fractionation of cells. By identifying and quantify protein expression with help of liquid chromatography-­‐mass spectrometry (LC-­‐MS) as a method, can we decide the effectiveness of fractionation in each fractionation method. Subcellular fractionation of proteins was divided in to a membrane component, cytosol component, cytoskeleton component and nuclear component. It was used Tert cells, which is mesenchymale stem cells. Proteins from the various fractions were separated in terms of molecular weight by SDS-­‐PAGE. Each gel lane from the individual subcellular fractions was divided in ten and the proteins were extracted from the gel and hydrolyzed with the protease trypsin. Further on, the peptides were separated and analyzed with liquid chromatography-­‐electrospray ionization-­‐ mass spectrometry/ mass spectrometry (LC-­‐ESI-­‐MS/MS). The peptides from each fraction were analyzed using LC-­‐ESI-­‐MS/MS setups (setupІ). SetupІ detected 361 proteins for the commercial fractionationkit ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction kit and 41 proteins from manual fractionations method. A part goal with this master thesis is to develop a method that makes it easier to control Site directed mutagenesis and sees if this has been correct accomplished. Chitosan B (ChiB) from Serratia marcescens, can be found in environments such as dirt and mutants form this was used as model proteins. Bye using three different methods, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, High Performance Liquid Chromatography (MALDI, HPLC) and Chemical Derivatization of mutants, we could se if the mutation was done correctly. The influence different matrix-­‐solutions had on the ionization of mutants were examined. This showed that it was very little difference in how easy it was to identify the mutants by using different matrix-­‐solutions. Sinapinic acid saturated with Ta30 (0%ACN(100%), 70% TFA (0,1%)) was esteemed better then sinapinic acid saturated with ETOH. ABSTRACT VIII We used HPLC coupled with mass spectrometry to separated and detect proteins in a solution. The settings were put to find all the sequences opportunities with and without missed cleavage. By missed cleavage we mean setting the number of allowed missed cleavage sites to zero simulates a limit digest. We are not confident that our digest (trypsin) is perfect, with no partial fragments present, this will give maximum discrimination and the highest score. We can also se in the table 3-­‐9 that we can control that the mutation has happened in the right spot for the mutants ChiB-­‐F190A, ChiB-­‐F191A and for the double mutant ChiB-­‐W97A/W220A. We used to chemical derivatization methods (SPITCand Lys-­‐Tag) for trypsin degradated proteins followed bye identifying proteins by MALDI-­‐TOF mass spectrometry. Lys-­‐Tag makes a different in the mass of +68 Da and makes the ε-­‐amino group of lysin to an imidazole ring. SPITC has a little bit bigger different in the mass, +215 Da. Derivatization was accomplished on the mutant ChiB-­‐W220A (figure 4.18 and 4.19), but the result was not approvable because we could not see the different in the mass of +68 Da for Lys-­‐Tag, and +215 Da for SPITC.