Estudo da viabilidade do extrato da castanha-do-brasil (Bertholletía excelsa) na criopreservação de sêmen bovino

Ministério da Educação e Universidade Federal Rural da Amazônia

A criopreservação de sêmen é amplamente utilizada para aumentar o potencial reprodutivo de animais de alto valor genético e zootécnico, entretanto, os protocolos utilizados resultam em considerável número de espermatozoides que sofrem algum tipo de lesão devido a formação de cristais de gelo, injúrias oxidativas, alterações na membrana do espermatozoide e toxicidade dos crioprotetores. Dessa forma, objetivou-se avaliar a viabilidade do uso do extrato da castanha-do-brasil (Bertholletia excelsa) na elaboração do meio crioprotetor em substituição à gema de ovo na criopreservação de sêmen bovino. Os tratamentos experimentais consistiram em 0, 25, 50, 75 e 100% de substituição da gema de ovo pelo extrato da castanha-do-brasil em meio crioprotetor, estabelecendo-se a mesma concentração de água destilada e Tryladil em todas as diluições. Foram utilizados cinco touros da raça Nelore com idades entre 24 e 36 meses, sendo o método para obtenção do material a eletroejaculação. O delineamento utilizado foi em blocos casualizados, considerando-se bloco cada animal, sendo assim definido por cinco blocos, cinco tratamentos e cinco repetições, sendo essa última os ejaculados. Os espermatozoides foram contabilizados em câmara de Neubauer para continuamente serem realizadas as diluições nos tratamentos experimentais e envase. Em seguida, as palhetas foram seladas, resfriadas, congeladas e armazenadas à -1960C. Após a descongelação, as amostras foram avaliadas quanto à morfologia, cinética (teste de termorresistência e análise computadorizada - CASA), integridade de membranas (teste hiposmótico e epifluorescência), e posteriormente Fertilização in vitro (FIV). Utilizou-se o teste contraste de regressão para os dados paramétricos e para os não paramétricos o Kruskal Wallis, ambos à 5% de significância. Foi utilizado o teste correlação de Pearson simples entre células íntegras ou lesadas com o potencial de membrana mitocondrial. Na análise morfológica, os defeitos menores e totais apresentaram efeito linear crescente em função da substituição, mostrando que à medida que aumentou-se a concentração do extrato, maior foi a quantidade de células que apresentaram defeitos; no teste hiposmótico observou-se efeito linear decrescente resultando em maior número de células com membranas lesadas à medida que foi substituindo a gema pelo extrato de castanha. Comportamento semelhante foi observado na análise de integridade de membranas por meio da epifluorescência, verificando-se maior número de células sem potencial de membrana mitocondrial e que apresentaram lesões quando substituiu-se 100% a gema de ovo pelo extrato. O teste de termorresistência apresentou efeito quadrático para motilidade nas horas zero e uma e efeito linear na segunda hora do teste; entretanto, o vigor apresentou diferença apenas na segunda hora, em função da substituição da gema de ovo pelo extrato de castanha-do-brasil. Também foi observado efeito quadrático para as motilidades total e progressiva avaliadas pelo CASA e taxa de clivagem na FIV, sendo todos os resultados influenciados negativamente com a substituição da gema de ovo pelo extrato da castanha-do-brasil. Dessa forma, a substituição da gema de ovo pelo extrato de castanha-do-brasil demonstrou não ser eficiente na criopreservação do sêmen, indicando que a fração de LDL da gema é imprescindível. Além disso, o teor de selênio encontrado no extrato foi considerado elevado e tóxico aos espermatozoides.

Semen cryopreservation is widely used to increase the reproductive potential of animais of high genetic and zootechnical value; however, the protocols used result in a considerable number of spermatozoa that suffer some kind of lesion due to the formation of ice crystals, oxidative injuries, alterations On the sperm membrane and cryoprotective toxicity. The objective of this study was to evaluate the feasibility of the use of Brazil nut extract (Bertholletia excelsa) in the elaboration of the cryoprotective médium in substitution of egg yolk for cryopreservation of bovine semen. Experimental treatments consisted of 0, 25, 50, 75 and 100% replacement of the egg yolk by Brazil nut extract in cryoprotectant médium, with the same concentration of distilled water and Tryladil being established at ali dilutions. Eive bulls of the Nelore breed were used between 24 and 36 months, being the method to obtain the material the electroejaculation. The experimental design was a randomized complete block design, with five blocks, five treatments and five replications. The spermatozoa were counted in the Neubauer chamber to continuously carry out the dilutions in the experimental and packaging treatments. The blades were then sealed, cooled, frozen and stored at -196 0 C. After thawing, the samples were evaluated for morphology, kinetics, membrane integrity (HOST and epifluorescence), and then IVF. The regression test was used for the parametric data and for the non-parametric Kruskal Wallis, both at 5% significance. We used the simple Pearson correlation test between intact or damaged cells with mitochondrial membrane potential. In the morphological analysis, the minor and total defects had an increasing linear effect as a function of the substitution, showing that as the concentration of the extract was increased, the number of defects was higher; In the HOST test, a linear decreasing effect was observed, resulting in a larger number of cells with damaged membranes as it replaced the yolk with the chestnut extract. Similar behavior was observed in the membrane integrity analysis through epifluorescence, with a higher number of cells without mitochondrial membrane potential and lesions when 100% egg yolk was replaced by the extract. TTR showed quadratic effect for motility at zero hours and one and linear effect at the second hour of the test; However, the vigor presented difference only in the second hour, due to the replacement of the egg yolk with the Brazilian nut extract. It was also observed a quadratic effect for the total and progressive motilities evaluated by the CASA and cleavage rate in the IVF, ali of which were negatively influenced by the substitution of the egg yolk for the Brazil nut extract. Thus, the substitution of the egg yolk for Brazil nut extract was not efficient in semen cryopreservation, indicating that the LDL fraction of the yolk is essential. In addition, the selenium content found in the extract was considered high and toxic to spermatozoa.