Evaluación de la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de Citomegalovirus humano | Evaluation of the in vitro immunomodulatory activity of a human Cytomegalovirus clinical isolate

El Citomegalovirus humano (HCMV) continúa siendo uno de los principales causantes de complicaciones en los pacientes trasplantados. A pesar de que existen varios reportes sobre la relación entre determinado(s) genotipo(s), el curso clínico e incluso el deceso del paciente, la identificación del genotipo de HCMV no se hace rutinariamente después de detectar la infección o la reactivación. Adicionalmente se sabe que este virus ejerce una compleja actividad inmunomoduladora, la cual al parecer le permite persistir en latencia en individuos inmunocompetentes, pero que en inmunosuprimidos puede facilitar la reactivación de la infección y la diseminación a diferentes compartimientos anatómicos y tejidos, hecho que puede estar relacionado con la gran variedad de complicaciones asociadas. El estudio in vitro de la actividad inmunomoduladora de HCMV se hace empleando cepas de referencia, con alto número de pasajes en cultivo celular, sin tomar en consideración las alteraciones genómicas producto de la adaptación, que pueden afectar el tropismo, la modulación inmunológica y la latencia, entre otros. Estas cepas se usan por la dificultad de obtener aislados clínicos de HCMV debido al ciclo replicativo lento y la probabilidad de coinfecciones. Es por esto por lo que se planteó evaluar y comparar la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de HCMV con cepas de referencia, en una línea celular de monocitos humanos. Para ello se plantearon tres estrategias metodológicas. En la primera se evalúo la posible relación entre los genotipos de HCMV con las complicaciones y el desenlace, en pacientes pediátricos receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos (RTPH). En segundo lugar, se establecieron las condiciones metodológicas para aislar y cosechar HCMV a partir de muestras clínicas; finalmente, se evaluó y comparó in vitro la activación y expresión de mediadores inflamatorios en una línea celular de monocitos/macrófagos infectados con el aislado clínico, teniendo como referencia el efecto que inducen dos cepas de laboratorio del HCMV. A continuación, se describe la metodología y los resultados obtenidos de cada uno de los objetivos planteados. HCMV se transmite por contacto próximo a través de fluidos corporales como la orina, leche materna y saliva, por lo que la mayoría de los individuos infectados han adquirido el virus en los primeros años de vida y aparece en estos fluidos en las descargas virales asintomáticas. Por otra parte, se han identificado cinco genotipos de HCMV lo que demuestra su variabilidad genética y algunos estudios sugieren una relación entre el genotipo infectante, las coinfecciones (más de un genotipo) y el desenlace, sobre todo en RTPH. Sin embargo, hasta el momento en el país la genotipificación no es un procedimiento rutinario y no se considera a la saliva como una muestra confiable, útil para su rastreo. Para evaluar esto, se obtuvieron 105 muestras de saliva de 20 pacientes pediátricos RTPH recolectadas semanalmente en la Unidad de Trasplante de Precursores Hematopoyéticos de la Fundación Hospital Pediátrico la Misericordia (UT-HOMI). Se confirmó la infección de HCMV por PCR detectando el gen UL83; y por PCR anidada y secuenciación se determinó el genotipo. Se detectó el ADN viral en 29 muestras de 12 pacientes y en todos los casos se confirmó el genotipo gB1, sin coinfecciones. Luego del análisis no se estableció ninguna relación entre la detección de HCMV en saliva, el genotipo identificado, con las complicaciones y el desenlace en el grupo de pacientes que participó en el estudio. Este resultado confirma la alta frecuencia de HCMV en los pacientes, la factibilidad de emplear la saliva para la detección y genotipificación de HCMV y la necesidad de evaluar la relación entre el genotipo(s) identificado(s) con el curso clínico del paciente trasplantado. De otro lado, la obtención de aislados clínicos a partir de fluidos corporales puede resultar difícil, por el tiempo que puede demorar la aparición de efecto citopático (ECP) y porque en los primeros pasajes las partículas virales permanecen asociadas a las células y la concentración es baja en el sobrenadante celular. En nuestro segundo objetivo se propuso aislar el HCMV a partir de muestras de orina, lavado broncoalveolar (LBA) y plasma de pacientes hospitalizados en el HOMI. De 61 niños evaluados, se obtuvieron 6 muestras de orina, 27 de LBA y 37 plasmas. De las 9 muestras positivas por PCR para HCMV, se hicieron diluciones que se inocularon sobre células MRC-5 utilizando la técnica de centrifugación (Shell-vial), luego se retiró el inóculo y se observaron diariamente. De las 5 muestras con ECP se recolectó el sobrenadante, el cual fue inoculado nuevamente en células MRC-5. Sobre estas últimas -con ECP atribuible a HCMV- se recolectó y almacenó a -80°C el lisado celular sonicado y el sobrenadante. En las células inoculadas con plasma el cultivo mostró daño celular temprano que impidió continuar con el aislamiento. Solo a partir de una muestra de LBA -negativa para Virus Herpes Simplex 1 y 2, Adenovirus, Enterovirus y Poliomavirus-, se logró el aislamiento y amplificación de un HCMV genotipo gB1, que denominamos B52, con un título de 2.18 x106 UFP/mL, luego de su segundo pasaje. Estos resultados muestran que la obtención de aislados clínicos a partir de las descargas virales asintomáticas en fluidos como la saliva, LBA y la orina puede ser eficaz y eficiente implementando algunas estrategias técnicas como el Shell vial y lisando las células, lo que mejora los títulos y permite obtener un aislado con muy bajos pasajes en cultivo. Finalmente, luego de la infección primaria, HCMV establece latencia en las células CD34+ y persiste en los monocitos de sangre periférica CD14+. En estas células, el HCMV modula la respuesta inmunológica: i) promoviendo la activación de los monocitos circulantes y su diferenciación a macrófagos tisulares; ii) regulando la secreción de algunas citocinas y iii) reclutando células inmunes; así, genera un ambiente proinflamatorio, al tiempo que regula la respuesta inmune antiviral. Esta actividad es uno de los atributos de HCMV que lo hace altamente patogénico en individuos inmunosuprimidos, como los RTPH. Para el estudio de la actividad inmunomoduladora de HCMV comúnmente se utilizan cepas de laboratorio como Towne y Merlin, en las que por su alto o bajo número de pasajes -respectivamente- se han establecido modificaciones genómicas comprometiendo segmentos importantes que cambian el tropismo y la patogenicidad. Aun así, estas cepas son usadas con frecuencia debido a la dificultad de obtener aislados clínicos. Para evaluar el efecto del aislado clínico B52 en la activación y expresión de mediadores inflamatorios se utilizó la línea celular monocítica THP-1; las células fueron infectadas a una MOI de 1, con el aislado o con las cepas de referencia (Towne o Merlin), aplicando el modelo latencia – reactivación. Como control de diferenciación y activación celular las THP-1 fueron tratadas (+) o no tratadas (-) con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), y evaluadas a las 48, 72 y 120 horas posinfección (hpi). Al cabo de cada uno de los tiempos, se evaluó por citometría de flujo la expresión de marcadores de diferenciación CD14, CD64, CD11b, CD68 y activación celular CD206 y HLA-DR. Por RT-qPCR la expresión relativa de los transcritos para las citocinas asociadas a la activación, diferenciación y movilización de monocitos/macrófagos como IFN e IFNβ; TNF, IL-1β, CXCL-10, IL-8 e IL-10. Finalmente, en el sobrenadante se cuantificó la concentración de algunos de estos y otros mediadores como IFNγ, IL-6, CCL-18, IL-12p70, CXCL-9, IL-4, RANTES, MCP-1, CCL-22, MIP-1β, FAS-L y los factores de crecimiento VEGF-A, PDGF-AB. La expresión de marcadores de superficie de las células infectadas y tratadas con PMA mostró una expresión mayor de los marcadores CD14 y CD11b respecto al control. El efecto del aislado clínico B52 sobre la expresión de CD206 y HLA-DR fue dependiente de la estimulación con PMA y se incrementó con el tiempo. Las cepas de laboratorio Merlin y Towne indujeron una expresión más temprana de estos marcadores con disminución a las 120 hpi. La expresión relativa de los transcritos mostró que B52 moduló diferencialmente en el tiempo la expresión de los interferones y las citocinas proinflamatorias TNFα, CXCL-10, IL-1β e IL-8 y sobrereguló la expresión relativa de IL-10, respecto a las cepas Merlin y Towne. Sobre las concentraciones de citocinas y factores de crecimiento en el sobrenadante se encontró que el efecto de la infección con B52 estuvo por encima del inducido por las cepas de laboratorio en la mayoría de los casos, además de observarse en las primeras 48 horas luego de la infección. El efecto del tratamiento con PMA fue variable y no siempre significó incremento de las concentraciones de los analitos. Finalmente, en la secreción de IL-10 y de FAS-L, se observó un efecto diferencial y temprano con niveles más altos inducido por B52, principalmente en las células PMA (-), en comparación con el efecto de las cepas de laboratorio.

Universidad El Bosque

Universidad Nacional de Colombia

Fundación Hospital Pediátrico la Misericordia HOMI

Doctor en Ciencias Biomédicas

Doctorado

Human cytomegalovirus (HCMV) continues to be a major cause of complications in transplant patients. Although there are several reports on the relationship between certain genotype(s), clinical course, and even patient death, HCMV genotype identification is not routinely done after infection or reactivation. In addition, it is known that this virus exerts a complex immunomodulatory activity, which apparently allows it to persist in latency in immunocompetent individuals, but in immunosuppressed individuals it can facilitate reactivation and dissemination to different anatomical compartments and tissues, a fact that may be related to the wide variety of associated complications. The in vitro study of the immunomodulatory activity of HCMV is done using reference strains, with a high number of passages in cell culture, without taking into consideration the genomic alterations resulting from adaptation, which can affect tropism, immunomodulation, and latency, among others. These strains are used because of difficulty in obtaining clinical isolates of HCMV due to the slow replicative cycle and the probability of co-infections. For this reason, it was proposed to evaluate and compare the in vitro immunomodulatory activity of a clinical isolate of HCMV with reference strains in a human monocyte cell line. For this purpose, three methodological strategies were proposed. First, we evaluated the possible relationship between HCMV genotypes with complications and outcome in pediatric hematopoietic stem cell transplant recipients (HSCTR). Secondly, the methodological conditions for isolating and harvesting HCMV from clinical samples were established; finally, the activation and expression of inflammatory mediators in an infected monocyte/macrophage cell line was evaluated and compared in vitro with the clinical isolate, taking as a reference the effect induced by two HCMV laboratory strains. The methodology and results obtained for each objective are described below. HCMV is transmitted by close contact through body fluids such as urine, breast milk and saliva, so most infected individuals have acquired the virus in the first years of life, and it appears in these fluids in asymptomatic viral discharges. Moreover, five HCMV genotypes have been identified, demonstrating its genetic variability, and some studies suggest a relationship between the infecting genotype, co-infections (more than one genotype) and outcome, especially in HSCTR. However, so far in Colombia genotyping is not a routine procedure and saliva is not considered a reliable sample, useful for tracking. To evaluate this, 105 saliva samples were obtained from 20 pediatric HSCTR patients collected weekly at the Hematopoietic Stem Cell Transplant Unit of the La Misericordia Pediatric Hospital Foundation (UT-HOMI). HCMV infection was confirmed by PCR detecting the UL83 gene; and by nested PCR and sequencing the genotype was determined. Viral DNA was detected in 29 samples from 12 patients and in all cases the gB1 genotype was confirmed, with no coinfections. After analysis, no relationship was established between the detection of HCMV in saliva, the genotype identified, with complications and outcome in the group of patients who participated in the study. This result confirms the high frequency of HCMV in patients, the feasibility of using saliva for HCMV detection and genotyping and the need to evaluate the relationship between the genotype(s) identified with the clinical course of the transplanted patient. On the other hand, obtaining clinical isolates from body fluids can be difficult because of the time it can take for the cytopathic effect (CPE) to appear and because in the first passages the viral particles remain associated with the cells and the concentration is low in the cell supernatant. Our second objective was to isolate HCMV from urine, bronchoalveolar lavage (BAL) and plasma samples from patients hospitalized at HOMI. Of 61 children evaluated, 6 urine, 27 BAL samples and 37 plasma samples were obtained. Of the 9 PCR-positive samples for HCMV, dilutions were made and inoculated on MRC-5 cells using the centrifugation technique (Shell-vial), then the inoculum was removed and observed daily. From the 5 samples with ECP, the supernatant was collected and re-inoculated on MRC-5 cells. On the latter -with ECP attributable to HCMV- the sonicated cell lysate and the supernatant were collected and stored at -80°C. In plasma-inoculated cells, the culture showed early cell damage that prevented further isolation. Only from a BAL sample -negative for Herpes Simplex Virus 1 and 2, Adenovirus, Enterovirus and Polyomavirus-, was the isolation and amplification of a HCMV genotype gB1, which we named B52, with a titer of 2.18 x106 PFU/mL, achieved after its second passage. These results show that obtaining clinical isolates from asymptomatic viral discharges in fluids such as saliva, BAL and urine can be effective and efficient by implementing some technical strategies such as vial shell and lysing the cells, which improves titers and allows obtaining an isolate with very low passages in culture. Finally, after primary infection, HCMV establishes latency in CD34+ cells and persists in CD14+ peripheral blood monocytes. In these cells, HCMV modulates the immune response by i) promoting the activation of circulating monocytes and their differentiation to tissue macrophages; ii) regulating the secretion of some cytokines and iii) recruiting immune cells; thus, it generates a proinflammatory environment, while regulating the antiviral immune response. This activity is one of the attributes of HCMV that makes it highly pathogenic in immunosuppressed individuals, such as HSCTR. For the study of the immunomodulatory activity of HCMV, laboratory strains such as Towne and Merlin are commonly used, in which due to their high or low number of passages -respectively-, genomic modifications have been established compromising important segments that change tropism and pathogenicity. Even so, these strains are frequently used due to the difficulty of obtaining clinical isolates. To evaluate the effect of the clinical isolate B52 on the activation and expression of inflammatory mediators, the monocytic cell line THP-1 was used; the cells were infected at an MOI of 1, with the isolate or with the reference strains (Towne or Merlin), applying the latency-reactivation model. As a control of cell differentiation and activation, THP-1 cells were treated (+) or untreated (-) with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), and evaluated at 48-, 72- and 120-hours post-infection (hpi). At each time point, the expression of differentiation markers CD14, CD64, CD11b, CD68 and CD206 and HLA-DR cell activation was evaluated by flow cytometry. By RT-qPCR the relative expression of transcripts for cytokines associated with monocyte/macrophage activation, differentiation, and mobilization such as IFNα and IFNβ; TNFα, IL-1β, CXCL-10, IL-8 and IL-10. Finally, the concentration of some of these and other mediators such as IFNγ, IL-6, CCL-18, IL-12p70, CXCL-9, IL-4, RANTES, MCP-1, CCL-22, MIP-1β, FAS-L and the growth factors VEGF-A, PDGF-AB were quantified in the supernatant. The surface marker expression of infected cells treated with PMA showed a higher expression of CD14 and CD11b markers compared to the control. The effect of clinical isolate B52 on CD206 and HLA-DR expression was dependent on PMA stimulation and increased with time. The laboratory strains Merlin and Towne induced earlier expression of these markers with decrease at 120 hpi. Relative transcript expression showed that B52 differentially modulated over time the expression of interferons and the proinflammatory cytokines TNFα, CXCL-10, IL-1β and IL-8 and overregulated the relative expression of IL-10, relative to the Merlin and Towne strains. On cytokine and growth factor concentrations in the supernatant, it was found that the effect of infection with B52 was above that induced by the laboratory strains in most cases, in addition to being observed in the first 48 hours after infection. The effect of PMA treatment was variable and did not always mean an increase in the concentrations of the analytes. Finally, in the secretion of IL-10 and FAS-L, a differential and early effect was observed with higher levels induced by B52, mainly in PMA (-) cells, compared to the effect of the laboratory strains.