Desenvolvimento e validação de métodos para quantificação de constituintes majoritários em óleos essenciais por ressonância magnética nuclear | Development and validation of methods for quantification of major constituents in essential oils by nuclear magnetic resonance

A cromatografia gasosa, com detector de massas (CG-EM) e de ionização de chamas (CG-DIC), é a técnica mais utilizada para identificação e quantificação dos constituintes de óleos essenciais. Apesar de ser extremamente sensível, a análise por CG é bastante demorada. Neste trabalho, métodos rápidos e eficientes usando RMN de 1H foram desenvolvidos e validados para determinação de α-bisabolol em óleo essencial de Eremanthus erythropappus (candeia); de α- pineno em óleos essenciais de Eucalyptus, Corymbia, Schinus terebinthifolius (pimenta rosa) e em derivados de terebintina (um líquido obtido por destilação de resina de coníferas). Também foi feita determinação simultânea de citronelal, de citronelol e de geraniol em óleos essenciais comerciais de Cymbopogon nardus e de Cymbopogon winterianus (citronela) usando RMN de 1H. Os resultados obtidos usando os métodos de RMN foram comparados aos obtidos pelo método cromatográfico usando normalização de áreas (CG-N), padronização interna (CG- PI) e padronização externa (CG-PE). Todos os parâmetros avaliados (seletividade, linearidade, exatidão/precisão, repetibilidade, robustez, estabilidade do analito e do padrão interno em solução) mostraram resultados satisfatórios de acordo com as resoluções normativas vigentes (ANVISA - RE 899 e ABNT - NBR 14029) para todos os métodos desenvolvidos. Embora RMN de 1H seja uma técnica menos sensível que CG, os métodos de RMN de 1H desenvolvidos atendem com sucesso à quantificação de constituintes majoritários em óleos essenciais. Análise de variância (ANOVA) e testes de Tukey com 95% de confiança mostraram que não houve diferença significativa entre os valores encontrados pelo método de RMN de 1H em relação aos métodos cromatográficos CG-N, CG-PI e CG-PE para determinação de α-pineno nos óleos avaliados. Entretanto, o método de RMN de 1H desenvolvido para quantificação de α- bisabolol em óleo essencial de candeia é adequado para 73% dos óleos avaliados. Os outros 27% dos óleos de E. erythropappus tem maior número de constituintes e o teor de α-bisabolol foi superestimado devido à sobreposição do sinal usado para quantificação deste terpeno com sinais dos compostos ar- curcumeno e β-bisaboleno, no espectro de RMN de 1H desses óleos. Essa limitação foi contornada pelo emprego da técnica de RMN de 1H bidimensional denominada COSY. Essa técnica, além de ser rápida (16 min), apresentou desvio padrão inferior a 0,3%. Para determinação de citronelal, citronelol e geraniol nos óleos essenciais comerciais de citronela, a similaridade entre os métodos CG-N, CG-PI e RMN de 1H também foi comprovada por análise de variância (ANOVA) e pelo teste de Tukey com 95% de confiança. Entretanto, as pequenas diferenças encontradas nos teores de citronelal (amostra C2) e de geraniol (amostras C3 e C6) usando o método de CG-N quando comparadas aos resultados obtidos pelos métodos de RMN de 1H e de CG-PI, confirmaram a dependência do método de CG-N com a definição de parâmetros para integração que incluem ou excluem picos no cromatograma, influenciando no teor dos analitos.

Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and with flame ionization detection (CG-FID) is the most used technique for identification and quantification of constituents of essential oil, respectively. Although highly sensitive, GC analysis is time consuming. In this work, fast and efficient methods using 1H NMR were developed and validated for determination of α-bisabolol in essential oils of Eremanthus erythropappus (candeia); α-pinene in essential oils of Eucalyptus, Corymbia, Schinus terebinthifolius (pink pepper), and turpentine derivatives (a liquid obtained by distillation of resin from conifers). Simultaneous determination of citronellal, citronellol, and geraniol in commercial essential oils of Cymbopogon nardus and Cymbopogon winterianus (citronella) using 1H NMR was also performed. The results obtained using the NMR methods were compared to those obtained by the chromatographic method using area normalization (GC-N), internal standardization (GC-IS) and external standardization (GC-ES). All parameters evaluated (selectivity, linearity, accuracy/precision, repeatability, robustness, analyte stability, and internal standard in solution) showed satisfactory in accordance with the current normative resolutions (ANVISA - RE 899 e ABNT - NBR 14029) for all methods developed. Although 1H NMR is a less sensitive technique than GC, the developed 1H NMR methods can be successfully used the quantification of major constituents in essential oils. Analysis of variance (ANOVA) and Tukey's tests with 95% confidence showed that there was no significant difference between the values found by the method of 1H NMR in relation to the chromatographic methods GC-N, GC-IS and GC-ES for determination of α-pinene in the evaluated oils. However, the 1H NMR method developed for quantification of α-bisabolol in essential oils of candeia is suitable for 73% of the evaluated samples. The remaining 27% of the E. erythropappus oils have a greater number of constituents and the β-bisabolol content was overestimated due to the overlap of the signal used for quantification of this terpene with signals of the ar- curcumene and β-bisabolene compounds in the 1H NMR spectrum of these oils. This limitation was circumvented by the use of the two dimensional 1H NMR contour map COSY. This technique in addition to being fast (16 min), showed a standard deviation of less than 0.3%. For quantification of citronellal, citronellol and geraniol in commercial citronella essential oils, the similarities between the GC-N, GC-IS and 1H NMR methods were also confirmed by analysis of variance (ANOVA) and Tukey's test with 95% reliable. However, the small differences found in citronellal (sample C2) and geraniol (samples C3 and C6) levels using the GC-N method when compared to the results obtained by 1H-NMR and CG-IS methods, confirmed the dependence of the method of CG-N with the definition of parameters for integration that include or exclude peaks in the chromatogram, influencing the analytes content.