In vivo and in vitro studies of degradation of inositol phosphates in the digestive tract of broiler chickens

Phosphorus (P) is an important element in poultry nutrition, which must be adequately supplied in the diet. However, for non-ruminant animals, it is only partially available from plant seeds—the major components of poultry diets—where P is predominantly bound as phytic acid (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis (dihydrogen phosphate); InsP6) and its salts, called phytate. InsP6-P can be utilized after the stepwise cleavage of the P from the phytate molecule by phytases and other phosphatases. After the theoretical complete dephosphorylation of InsP6, six phosphate groups and myo-inositol (MI) are potentially available for absorption. Recent studies assume an effect of MI on growth performance when it is added in its free form to the diet or released as a result of InsP6 breakdown. Because P is of specific economic and environmental relevance, the improvement of the digestibility of plant P in poultry is of great interest. The overarching aim of this thesis was therefore to gain a deeper insight into the degradation of InsPs in the digestive tract of broiler chickens, with a focus on the intermediate and end-products as influenced by the diet composition. An in vitro assay was established to study the disappearance of InsP6 and the formation of lower inositol phosphate (InsP) isomers in the poultry digestive tract. The assay simulates the conditions (pH, temperature, proteolytic enzymes, water content, and retention time) of the crop, stomach, and small intestine, using a poultry diet as matrix. The assay yielded highly reproducible results and was sensitive to the factors that varied in the three experiments. A diminishing effect on InsP degradation was found by the supplementation of P and Ca. The described assay is a suitable tool that can be used to screen feed enzymes and to investigate the effects of supplements in the absence of endogenous phytases. The first in vivo experiment aimed to distinguish between the single and interactive effects of P, calcium (Ca), and phytase. Effects on lower InsP esters and their isomers and MI in different segments of the digestive tract, and on the prececal digestibility of P, Ca, and amino acids (AAs) in broiler chickens were studied. Moreover, a complete picture was drawn of all dephosphorylation steps from InsP6 to MI in the digesta of the terminal ileum. The dietary treatments included diets without (P-) or with (P+) monosodium phosphate supplementation, without (Ca-) or with (Ca+) additional limestone supplementation, and without or with 1500 FTU phytase/kg feed. Up to the terminal ileum, InsP6 disappearance was found to decrease in P+Ca-, and even more so in P+Ca+, when no phytase was added. Adding phytase removed all effects of P and Ca. However, P+Ca+ increased the concentrations of lower InsP esters and reduced free MI in the ileum, even in the presence of phytase. Supplementation with phytase increased the concentration of MI in all segments of the digestive tract and in blood plasma, demonstrating the ability of broilers to fully degrade phytate and absorb the released MI. While the prececal AA digestibility was not affected by P and Ca or an interaction between P, Ca, and phytase, it increased with the addition of phytase. The objective of the second in vivo experiment was to investigate the effects of supplementation with free MI or graded levels of phytase on InsP degradation, concentrations of MI in the digestive tract and blood, bone mineralization, and prececal digestibility of AA. Birds were fed a control diet with adequate levels of all nutrients without or with MI supplementation, or one of three experimental diets that differed in phytase level, with reduced P and Ca levels. These outcomes indicate that MI might have been a relevant cause for the increase in gain:feed. Therefore, it is likely that the release of MI after complete dephosphorylation of phytate is one of the beneficial effects of phytase, along with the release of P and improvement in digestibility of other nutrients. It can be concluded that the established in vitro assay is a suitable tool to investigate effects on feed enzymes or differences between different feed enzymes in a feed matrix under standardized conditions without the interference of endogenous phytases, or depending on animal-specific variations. Based on the outcome of the in vitro and in vivo experiments of the present project, the combined supplementation of P and Ca—rather than supplementation of P or Ca solely—seems to be crucial for InsP degradation. There is now some evidence that MI can affect the growth and feed efficiency of broiler chickens without affecting the metabolism of InsPs or AAs. As the results regarding the effects of P and Ca on InsP6 degradation or phytase effects on AA digestibility are not consistent across studies, and studies investigating the effects of MI are scarce and not consistent, further systematic research is needed.

Phosphor (P) ist ein essentielles Element in der Geflügelernährung, das in ausreichender Menge zugeführt werden muss. Aus Pflanzensamen ist er für Nicht-Wiederkäuer nur teilweise verfügbar, da er dort hauptsächlich als Phytinsäure (Myo-Inositol 1,2,3,4,5,6-Hexakisdihydrogenphosphat; InsP6) und deren Salz, dem Phytat, gebunden ist. InsP6-P kann nach schrittweiser Spaltung des P vom Phytatmolekül durch Phytasen oder Phosphatasen vom Tier genutzt werden. Nach vollständiger Dephosphorylierung von InsP6 stehen dem Tier sechs Phosphatgruppen und das Myo-Inositol (MI) zur Verfügung. Neuere Studien vermuten einen Effekt von MI auf die Wachstumsleistung von Broilern, entweder durch freies MI nach Supplementierung oder freigesetzt nach vollständigem InsP6-Abbau. Da P von großer ökonomischer und ökologischer Relevanz ist, ist die Verbesserung der Verfügbarkeit des Pflanzen-P für Geflügel von höchstem Interesse. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es deshalb, einen tieferen Einblick in den Abbau von Inositolphosphaten bei Broilern in Abhängigkeit der Futterzusammensetzung zu gewähren, mit Fokus auf die Zwischenabbau- und Endprodukte. Ein in vitro System wurde etabliert, um den InsP6-Abbau und die Bildung niederer InsP-Isomere im Verdauungstrakt des Geflügels zu untersuchen. Das in vitro System simuliert die Bedingungen (pH-Wert, Temperatur, Verdauungsenzyme, Wassergehalt, Retentionszeit) in Kropf, Magen und Dünndarm basierend auf einer Futtermatrix. Der Einfluss verschiedener Rationen mit unterschiedlichen Komponenten und Zusätzen wurde untersucht. Das System lieferte höchst reproduzierbare Ergebnisse und war sensitiv auf die Faktoren, die variiert wurden. Die Zulage von P und Calcium (Ca) führte zu einem reduzierten InsP-Abbau. Das in vitro System ist leicht zu handhaben und hat eine hohe Reproduzierbarkeit, was es zu einer schnellen und praktikablen Methode zur Untersuchung des Abbauweges von InsP6 unter standardisierten Bedingungen macht. Das Ziel des ersten in vivo Versuchs war die Unterscheidung zwischen Einzel- und Interaktionseffekten von P, Ca, und Phytase. Untersucht wurden Effekte auf niedere InsPs und deren Isomere, sowie auf MI in verschiedenen Abschnitten des Verdauungstrakts des Broilers und auf die praecaecale Verdaulichkeit von P, Ca und Aminosäuren (AS). Zudem konnte ein vollständiges Bild aller Abbaustufen von InsP6 bis MI im terminalen Ileum dargestellt werden. Die Versuchsrationen umfassten Rationen ohne (P-) oder mit (P+) Mononatriumphosphat-Zulage, ohne (Ca-) oder mit (Ca+) zusätzlicher Futterkalk-Zulage und ohne oder mit Phytase. Bis zum terminalen Ileum wurde das InsP6-Verschwinden reduziert in P+Ca- und noch weiter in P+Ca+, wenn keine Phytase zugesetzt war. Durch Zulage der Phytase verschwanden diese Effekte. Jedoch erhöhte P+Ca+ die Konzentration der niederen InsP-Isomere und reduzierte die MI-Konzentration im Ileum, selbst wenn Phytase zugesetzt war. Die Zugabe von Phytase erhöhte die Konzentration von MI in allen Verdauungstraktabschnitten und im Blutplasma, was auf die Fähigkeit des Broilers hinweist, InsP6 vollständig abzubauen und freigesetztes MI zu absorbieren. Die praecaecale AS Verdaulichkeit wurde nicht von den P- und Ca-Zulagen oder einer Interaktion zwischen P, Ca und Phytase beeinflusst, aber durch den Zusatz der Phytase erhöht. Das Ziel des zweiten in vivo Versuchs war es, den Effekt einer Zugabe von freiem MI oder steigenden Konzentrationen einer Phytase auf den InsP Abbau, die Konzentration von MI im Verdauungstrakt und Blut, sowie die Knochenmineralisierung zu untersuchen. Die Broiler bekamen jeweils eine von fünf Rationen: Die Kontrollration war ausreichend in allen Nährstoffen und ohne oder mit einer Supplementierung von MI. Drei weitere Versuchsrationen unterschieden sich in ihrem Phytasegehalt, wobei ihr P- und Ca-Gehalt reduziert wurde. Die Ergebnisse sind ein Hinweis darauf, dass MI einen relevanten Beitrag zur erhöhten Futtereffizienz geleistet haben könnte. Demnach ist es möglich, dass die Freisetzung von MI nach vollständiger Dephosphorylierung von InsP6 eine der vorteilhaften Wirkungen von Phytasen, neben der Freisetzung von P und der verbesserten Verdaulichkeit anderer Nährstoffe, ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in vitro System ein geeigneter Ansatz ist, um Effekte auf Futterenzyme oder Unterschiede zwischen verschiedenen Futterenzymen in einer Futtermatrix unter standardisierten Bedingungen zu untersuchen. In vitro und in vivo zeigte sich, dass sich die gemeinsame statt einer alleinigen Zulage von P und Ca reduzierend auf den InsP-Abbau auszuwirken. Es gibt nun einige Hinweise darauf, dass MI das Wachstum und die Futtereffizienz von Broilern positiv beeinflussen kann. Da sich die Ergebnisse bezüglich der Effekte von P und Ca auf den InsP6-Abbau und bezüglich Phytaseeffekten auf die AS-Verdaulichkeit in der Literatur sehr unterscheiden und Studien zur Wirkung von MI noch sehr spärlich sind, sind nun weitere systematische Studien nötig.