Evaluation of new open pollinating broccoli genotypes (Brassica oleracea convar. botrytis var. italica) specifically bred for organic farming conditions focusing on agronomic performance and glucosinolate content

Currently, a considerable share of varieties being used in the organic vegetable production are developed for conventional high-input production systems, and broccoli is no exception. In addition, F1 hybrids are cultivated in organic broccoli production to a great extent because of high quality and yield. Two main restrictions of cultivating the mentioned categories of varieties in organic farming are; 1) ban of using cytoplasmic male sterility (CMS) in organic agriculture for reproduction of F1 hybrids of broccoli and limitations of farmers to produce their own seeds, 2) absence of special traits of these varieties which result in weaker performance when being cultivated under organically low-input conditions. In contrast to hybrids, cultivation of open pollinating broccoli varieties gives the opportunity of reproducing seeds to organic farmers. Therefore, developing new open pollinating broccoli varieties, which have the same quality (agronomical, chemical and sensorial) as F1 hybrids, through organic breeding programs (on-farm breeding) would allow the organic broccoli farmers to replace the hybrids with varieties adapted to organic production conditions. With this in mind, the German Federal office for Agriculture and Food (BLE) initiated a project on “Breeding development of open pollinating cultivars of broccoli for organic farming in terms of agronomic characteristics, secondary and bioactive ingredients and sensory properties”. This was a joint project which was done through the cooperation of University of Hohenheim and Kultursaat e. V. (NGO of on-farm breeders) in two parts during six years (2011-2016). The present doctoral thesis, which was a part of the mentioned project, aims at 1) investigating the agronomic performance of the newly bred open pollinating genotypes of broccoli, 2) developing a Near-Infrared Spectroscopy (NIRS) method for fast analysis of total, indole, aliphatic and individual glucosinolates content of broccoli samples; and 3) determining the total and individual glucosinolate content of the newly bred open pollinating genotypes of broccoli. For investigations on agronomic performance, two field experiments were carried out by cultivating eleven newly bred open pollinating genotypes, two F1 hybrids and an open pollinating variety of broccoli over two growing seasons of fall 2015 and spring 2016. Evaluation of the effect of genotype, growing season and their interactions on agronomic parameters were targeted in this study. According to our findings, assessment of agronomic variables indicated that although there were distinctions in different parameters such as head firmness, head shape and total biomass fresh weight among the newly bred open pollinating genotypes, some genotypes performed similar to hybrid varieties in organic farming. However, most of the open pollinating genotypes had 16 % to 73 % lower yields compared to the hybrid varieties depending on growing season. Generally, the “marketable yield” of the genotypes was under the significant effect of “genotype × growing season interaction”. Head weight was significantly affected by growing season which resulted in significantly lower head weight of some genotypes in the spring compared to the fall season. Overall, cultivation of the genotypes in fall season led to significantly higher marketable yields, head weight and total biomass weight, as well as firmer heads in contrast to the spring season. Considering the performance of different agronomic parameters, we recommend genotypes “TH-CAN-SPB”, “Calinaro”, “CHE-GRE-G” for both fall and spring growing season. Other genotypes such as “CHE-GRE-A”, “CHE-BAL-A” and “CHE-MIC” and “Line 701” are also recommended for cultivation in spring growing season specifically due to the high marketable yield and share of marketable heads. In addition, this thesis aimed at testing a fast analytical technique for determination of glucosinolates content in order to help breeders to quickly test their most favorable genotypes during breeding procedures based on glucosinolates content. For this purpose, the accuracy of NIRS technic was tested, regardless of type of genotype, for fast analysis of the individual and total glucosinolates content of broccoli samples. NIRS calibration was developed by reference method of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) based on modified partial least squares regression, to measure individual and total glucosinolates content of open pollinating genotypes of broccoli regardless of the type of genotype. The calibration was analyzed using coefficient of determination in prediction (R2) and ratio of preference of determination (RPD). Large variation occurred in the calibrations, R2 and RPD due to the variability of the samples. Derived calibrations for total glucosinolates (RPD = 1.36), aliphatic glucosinolates (RPD = 1.65), glucoraphanin (RPD = 1.63) and 4-methoxyglucobrassicin (RPD = 1.11) were quantitative with a high accuracy, while for indole glucosinolates (RPD = 0.95), glucosinigrin (RPD = 0.62), glucoiberin (RPD = 0.67), glucobrassicin (RPD = 0.81) and neoglucobrassicin (RPD = 0.56) they were more qualitative. Overall, the results showed a good potential of NIRS in determination of different glucosinolates in a large sample pool of broccoli quantitatively and qualitatively. The achieved calibration equations were used to measure glucosinolates content of the broccoli samples of following years. To evaluate the health beneficial value of the open pollinating genotypes, the glucosinolates content of them were determined. The determination was done by the tested NIRS technic. Six individual glucosinolates were detected in the broccoli samples similar to findings of the previous chapter. Glucoraphanin (1.44-1.69 µmol g-1 DW), glucobrassicin (0.63-0.77 µmol g-1 DW) and neoglucobrassicin (0.38-0.74 µmol g-1 DW) had the highest share and were the main individual glucosinolates. Total glucosinolates content ranged from 3.46 to 3.60 µmol g-1 DW across both growing season. Significant effect of genotype and growing season existed on the total glucosinolates content of broccoli samples. All individual glucosinolates were affected by genotype. The effect of growing season was significant on all individual glucosinolates, except for glucobrassicin. The interaction of genotype × growing season was significant on all indole glucosinolates, glucoraphanin and glucoiberin. Generally, the glucosinolates content of the samples were higher when broccoli genotypes were cultivated in the fall growing season, however the difference in the level of glucosinolates contents across seasons was significant only for glucoraphanin, neoglucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin and glucoiberin. The open pollinating genotypes showed a similar range of glucosinolates compared to the tested hybrids and performed as good as the hybrids. Since total glucosinolates were nearly similar in all open pollinating genotypes across seasons, all are recommended for cultivation in both growing seasons. It is important to note that this study only focused on a single health beneficial compound (glucosinolate) in broccoli heads. To provide a full insight into the nutritive and health benefiting compounds of broccoli such as vitamins and polyphenols, supplementary studies will have to be conducted. All in all, releasing new open pollinating broccoli varieties out of this pool of genotypes and replacing the present varieties with them seemed beneficial due to the well adapted agronomic performance and high health value with regard to glucosinolates content under organic farming conditions.

Derzeit werden im ökologischen Gemüsebau vor allem Sorten genutzt, die für den konventionellen Anbau entwickelt wurden. Brokkoli bildet hier keine Ausnahme. Im ökologischen wie im konventionellen Anbau werden bei Brokkoli zudem vor allem F1-Hybride angebaut, um einen hohen Ertrag und eine gute Produktqualität sicherzustellen. Dabei treten speziell im Ökologischen Landbau folgende Herausforderungen auf: 1) einige Öko-Anbauverbände (z.B. Demeter e.V., Bioland e.V.) verbieten die Sorten, deren Züchtung auf dem Einsatz von cytoplasmatisch-männlicher Sterilität (CMS) für die Reproduktion von F1-Hybriden beruht, 2) der Einsatz von Hybriden ermöglicht nicht den Nachbau von eigenem Saatgut durch die Landwirte und 3) die aktuell auf dem Markt befindlichen Sorten sind nicht an die Low-Input-Bedingungen im Ökologischen Landbau angepasst, was gerade bei einer N-intensiven Kultur wie Brokkoli häufig mit verminderten Erträgen einhergeht. Darüber hinaus wird im verfügbaren Sortensortiment bislang kein Augenmerk auf gesundheitsfördernde Inhaltsstoffe und mögliche Unterschiede zwischen den Sorten gelegt. Bei Brokkoli spielen jedoch Glucosinolate als gesundheitsfördernde Inhaltsstoffe eine große Rolle, da ihnen eine krebsvorbeugende Wirkung nachgesagt wird. Ziel ist es daher, für die Bedingungen des Ökologischen Landbaus neue samenfeste Brokkoli-Sorten durch ökologische Zuchtprogramme on-farm zu entwickeln. Idealerweise zeichnen sich diese Sorten durch ähnlichen Eigenschaften (agronomisch, chemisch und sensorisch) wie F1-Hybriden aus, könnten diese somit im Ökologischen Landbau ersetzen. Vor diesem Hintergrund wurde in Rahmen des „Bundesforschungsprogramms für Ökologischen Landbau und andere Formen der Nachhaltigen Landwirtschaft“ das Projekt „Züchterische Entwicklung von samenfesten Sorten von Brokkoli für den biologischen Landbau in Bezug auf agronomische Merkmale, sekundäre und bioaktive Inhaltsstoffe und sensorische Eigenschaften“ gefördert. Es fand in Kooperation zwischen der Universität Hohenheim und Kultursaat e.V. (Verein zur On-Farm-Züchtung ökologischer Gemüsesorten) statt und lief über zwei Förderperioden von insgesamt sechs Jahren (2011-2016). Die vorliegende Doktorarbeit, welche ein Teil dieses Projektes war, umfasst 1) die Erfassung und Bewertung der agronomischen Parameter neu gezüchteter samenfester Brokkoli-Genotypen unter den Anbaubedingungen des Ökologischen Landbaus; 2) die Entwicklung einer Nahinfrarotspektroskopie (NIRS)-Methode für die schnelle Analyse der Gesamtglucosinolatgehalte, der indolischen und aliphatischen Fraktion sowie der einzelnen Glucosinolate für Brokkoli; und 3) die Bestimmung der Glucosinolate (Gesamtgehalte, indolische und aliphatische Fraktion, Einzelsubstanzen) der neu gezüchteten samenfesten Brokkoli-Genotypen. Für die Untersuchung der agronomischen Parameter wurden zwei Feldexperimente mit elf neuen samenfesten Genotypen, zwei F1 Hybriden und einer samenfesten Sorte über zwei An-bauzeiträume im Herbst 2015 und im Frühjahr 2016 durchgeführt. In diesen Versuchen wur-den die Faktoren „Genotyp“, „Anbauzeitraum“, „Erntezeitpunkt“ und deren Interaktionen untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass einige der neuen samenfesten Brokkoli-Genotypen ähnliche Merkmale aufwiesen wie die Hybriden. Hinsichtlich der Merkmale, z.B. Festigkeit der Blume, Blumenform sowie Gesamtbiomasseertrag (Frischgewicht) konnten sig-nifikante Unterschiede zu den Hybriden gezeigt werden. Weiterhin wiesen die meisten der samenfesten Genotypen in Abhängigkeit vom Anbauzeitraum um 16 % bis 73 % geringere Erträge im Vergleich zu den Hybridsorten auf. Grundsätzlich beeinflusste die Interaktion „Genotyp × Anbausaison“ den marktfähige Ertrag. Das Gewicht der Blume wurde signifikant vom Anbauzeitraum beeinflusst; im Vergleich zum Herbstanbau führte der Frühjahrsanbau bei den meisten Genotypen zu signifikant niedrigeren Blumengewichten. Insgesamt wurden im Herbstanbau signifikant höhere Erträge an marktfähigen Blumen, höhere Blumengewichte, eine höhere Gesamtbiomasse sowie festere Blumen als im Frühjahrsanbau ermittelt. Hinsichtlich ihrer agronomischen Parametern können die Genotypen „TH-CAN-SPB”, „Calinaro” und „CHE-GRE-G” für die Herbst- und Frühjahrsanbau empfohlen werden, während die Genotypen „CHE-GRE-A“, „CHE-BAL-A“, „CHE-MIC“ und „Linie 701“ besser für den Frühjahrsanbau geeignet scheinen. Um in der ökologischen Brokkoli-Züchtung auf gesundheitsfördernde Inhaltsstoffe selektieren zu können, ist es nötig, eine schnelle und kostengünstige Methode einzuführen, mit der die Glucosiolatgehalte in den Einzelpflanzen bestimmt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher mit Hilfe der Referenzmethode der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eine Kalibrierung für einzelne Glucosinolate sowie für den Gesamtgehalt an Glucosinolaten für NIRS entwickelt. Die Kalibrierung erfolgte über eine Regressionsfunktion (modifizierte Methode der kleinsten Quadrate) wobei die Güte des Fits durch das Bestimmtheitsmaß (R2) und die „ratio of preference of determination“ (RPD) geprüft wurde. Aufgrund der Heterogenität der Proben traten große Schwankungen bei der Kalibrierung auf. Die ermittelten Kalibrierungen für den Gesamtglucosinolatgehalt (RPD = 1,36), die aliphatischen Glucosinolate (RPD = 1,65), Glucoraphanin (RPD = 1,63) und 4-Tethoxyglucobrassicin (RPD = 1,11) waren quantitativ von einer hohen Genauigkeit, während die Kalibrierungen bei den indolischen Glucosinolaten (RPD = 0,95), Glucosinigrin (RPD = 0,62), Glucoiberin (RPD = 0,67), Glucobrassicin (RPD = 0,81) und Neoglucobrassicin (RPD = 0,56) nur für eine qualitative Bestimmung geeignet waren. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass NIRS zur quantitativen und qualitativen Bestimmung verschiedener Glucosinolate bei einer hohen Anzahl von Brokkoli-Proben geeignet ist. Die Kalibrierungen wurden in den Folgejahren genutzt, um die Glucosinolatgehalte und damit den Gehalt an gesundheitsfördernden Inhaltstoffen in den neuen samenfesten Brokkoli-Genotypen zu analysieren. Glucoraphanin (1,44-1,69 µmol g-1 Trockemasse (TM), Glucobrassicin (0,63-0,77 µmol g-1 TM) und Neoglucobrassicin (0,38-0,74 µmol g-1 TM) waren die dominierenden Glucosinolate in allen getesteten Genotypen und Hybriden. Der Gesamtgehalt an Glucosinolaten reichte von 3,46 bis 3,60 µmol g-1 TM in beiden Anbauzeiträumen, wobei die Faktoren „Genotyp“ und „Anbausaison“ statistisch signifikant waren. Alle einzeln untersuchten Glucosinolate waren vom Faktor „Genotyp“ beeinflusst, der Faktor „Anbausaison“ war bei allen außer bei Glucobrassicin signifikant. Die Interaktion Genotyp × Anbausaison war bei den indolischen Glucosinolaten sowie bei Glucoraphanin und Glucoiberin signifikant. Grundsätzlich war der Glucosinolatgehalt im Herbstanbau höher, jedoch war der Unterschied nur für Glucoraphanin, Neoglucobrassicin, 4-Methoxyglucobrassicin und Glucoiberin signifikant. Die samenfesten Genotypen zeigten ähnliche Glucosinolatgehalte wie die untersuchten Hybriden. Die Gesamtglucosinolatgehalte waren in allen samenfesten Genotypen in beiden Anbauzeiträumen ähnlich. Daher kann die Auswahl der anzubauenden Sorten bzw. Genotypen unabhängig vom Glucosinolatgehalt erfolgen und die Landwirte können anhand der geprüften agronomischen Merkmale sowie des möglichen Ertragspotenzials ihre Sorten selektieren. Es ist jedoch wichtig darauf hinzuweisen, dass diese Studie sich nur auf die gesundheitsfördernden Verbindungen der Glucosinolate konzentrierte. Um einen vollen Einblick in die Nähr- und gesundheitsfördernden Stoffe in Brokkoli, wie Vitamine und Polyphenole zu bieten, müssen ergänzende Studien durchgeführt werden. Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass einige der untersuchten samenfesten Brokkoli-Genotypen geeignet sind, derzeit gängige Hybrid-Sorten im Ökologischen Landbau zu ersetzen, da sie gute agronomische Eigenschaften aufweisen, hohe Gehalte an gesundheitsfördernden Glucosinolaten aufweisen und an die speziellen Bedingungen des Ökologischen Landbaus angepasst sind.