Mechanistic aspects of the eco-physiology of Fusarium oxysporum f. sp. cubense TR4

Banana and plantain (Musa spp.), here termed as bananas, are a source of food security and income for more than 400 million people globally. Banana production is threatened by Fusarium wilt disease, caused by the soilborne root-infecting fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc). Foc Tropical Race 4 (Foc TR4) is considered the most virulent race of Foc and has gained notoriety due to its inexorable spread and devastating impact on banana cultivation. Host infection occurs when pathogen propagules, called chlamydospores, germinate and produce hyphae that penetrate host roots and subsequently invade host tissues. Infection occurs in a narrow zone of soil immediately adjacent to the roots, called rhizosphere. The rhizosphere is notable for the extensive interactions between roots, the microbiome, and soil physico-chemical factors. Banana rhizosphere interactions are poorly understood, yet profoundly influence infection and development of Fusarium wilt. It is speculated that a better understanding of banana rhizosphere interactions will improve management of Fusarium wilt through the reduction of the abundance and/or efficacy of inoculum or enhance the disease suppressiveness of soils. Hence, the overarching objective of this doctoral study was to contribute to the fundamental ecological understanding of banana rhizosphere interactions related to Foc. The first study of this thesis analysed literature from four electronic databases (AGRIS, CAB Direct, SciVerse Scopus, ProQuest) to bring together the relatively scant data available on banana rhizosphere interactions and to highlight the key knowledge gaps. Analysis of 2,281 publications revealed the complexity of banana rhizosphere interactions and the driving factors of Fusarium wilt, for which the mechanisms remain poorly understood. Data from the literature shows that management of Fusarium wilt through rhizosphere manipulation is a dominant element albeit with limited success in the field. Notably, the data from literature shows that biological control agents (bacterial and fungal strains) are highly effective in vitro and in the greenhouse with a mean efficacy of 77.1% and 73.5%, respectively, but efficacy remains below 25.0% under field conditions. The second study of this thesis provides empirical evidence for suppression of Foc TR4 by root-secreted phenolic acids of non-host plants. Hydroponic culture and targeted metabolite analysis of root exudates of two legumes, Desmodium uncinatum and Mucuna pruriens, identified phenolic compounds such as benzoic-, t-cinnamic-, and p-hydroxybenzoic acid with inhibitory potential. These phenolic compounds suppressed Foc TR4 by inhibition of chlamydospore germination, production of new spores, and hyphal growth, and specifically also the biosynthesis of fusaric acid and beauvericin toxins, which are essential in the biology of the fungus. The third study of this thesis provides empirical evidence that the process of chlamydospore germination in Foc TR4 is developmentally orchestrated and iron-dependent. Scanning electron microscopy showed that iron-starved chlamydospores are unable to form a germ tube and exhibit reduced metabolic activity. Moreover, germination exhibits plasticity regarding extracellular pH, where over 50% germination occurs between pH 3 and pH 11. This suggests that disease suppression by manipulation of soil pH may not necessarily act via alteration of iron bioavailability. The requirement for iron was further investigated by assessing the expression of two genes (rnr1 and rnr2) that encode ribonucleotide reductase (RNR), the enzyme that controls cell growth through DNA synthesis. Expression of rnr2 was significantly induced in iron-starved chlamydospores compared to the control. The fourth study assessed the production of microbial iron-sequestering metabolites (siderophores) as a potential mechanism to counteract iron starvation. Specifically, ferrichrome, a hydroxamate siderophore, was synthesized exclusively in the mycelia of iron-starved cultures, which suggests de novo biosynthesis. Moreover, amino acid precursors for siderophore biosynthesis (ornithine, arginine) were altered by iron starvation. Collectively, this doctoral thesis extends the fundamental understanding of the biology and ecology of Foc TR4 and provides a base for realizing the potential of rhizosphere manipulation for management of Fusarium wilt.

Bananen und Kochbananen (Musa-Arten), die der Ernährungssicherung und dem Einkommen von weltweit mehr als 400 Millionen Menschen dienen, sind von der Fusarium-Welke bedroht, die auf dem bodenbürtigen Pilz Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) beruht. Die Rasse Foc Tropical Race 4 (Foc TR4) gilt als diejenige mit der höchsten Virulenz und ist bekannt für ihre rasche Ausbreitung und die verheerenden Wirkungen in Bananenplantagen. Zur Fortpflanzung bildet das Pathogen sogenannte Chlamydosporen, die nach ihrer Keimung Hyphen produzieren. Die Infektion erfolgt in der Rhizosphäre, wo die Hyphen über die Wurzeln in das Wirtsgewebe eindringen. Die Rhizoshpäre ist bedeutend für die intensiven Interaktionen zwischen Wurzel und dem Mikrobiom sowie den physikalisch-chemischen Faktoren im Boden. Über die Rhizosphäre-Interaktionen bei Bananen ist noch wenig bekannt. Sie haben jedoch erheblichen Einfluss auf den Befall und die Entwicklung der Fusarium-Welke. Es ist davon auszugehen, dass genauere Kenntnisse der Bananen-Rhizospäre-Interaktionen das Management der Fusarium-Welke verbessern werden, und zwar durch die Reduktion der Abundanz und/oder der Wirksamkeit des Inokulums, oder durch die Erhöhung der krankheitsunterdrückenden Wirkung des Bodens. Das übergeordnete Ziel dieser Doktorarbeit war es entsprechend, zum fundamentalen Verständnis der Bananen-Rhizospäre-Interaktionen im Zusammenhang mit Foc TR4 beizutragen. Die erste Studie dieser Arbeit umfasste die Literaturanalyse aus elektronischen Datenbanken (AGRIS, CAB Direct, SciVerse Scopus, ProQuest), um die relativ spärlich verfügbaren Daten zu den Interaktionen in der Bananen-Rhizosphäre im Zusammenhang mit der Fusarium-Welke zusammenzustellen und die Wissenslücken aufzuzeigen. Die Analyse von 2,281 Publikationen zu Bananen-Rhizosphäre Interaktionen und den bestimmenden Faktoren für die Fusarium-Welke zeigte die Komplexität der wenig verstandenen Mechanismen. Literaturdaten ergaben, dass Manipulationen der Rhizosphäre die vorherrschenden Ansätze darstellen, jedoch mit begrenzten Erfolgen unter Feldbedingungen. Biologische Kontrollagenten (Bakterien- und Pilz-Stämme) sind sehr effektiv in vitro und unter Gewächshausbedingungen mit durchschnittlichen Wirksamkeiten von 77.1% bzw. 73.5%. Unter Feldbedingungen lag die Wirksamkeit jedoch unter 25%. Die zweite Studie dieser Arbeit liefert empirische Beweise für die Unterdrückung von Foc TR4 durch Phenolsäuren, die von den Wurzeln von nicht-Wirtspflanzen abgegeben wurden. In Hydrokulturen und in gezielten metabolischen Analysen der Wurzelexudate zweier Leguminose-Arten (Desmodium uncinatum und Mucuna pruriens) zeigten Phenolverbindungen wie Benzoe-, t-Zimt- und p-Hydroxybenzoe-Säure ein inhibitorisches Potenzial. Diese Verbindungen unterdrückten Foc TR4 durch Hemmung der Chlamydosporenkeimung, der Neuproduktion von Sporen, des Hyphenwachstums und insbesondere der Biosynthese von Fusarinsäure und toxischen Beauvericinen, die in der Biologie des Pilzes essenziell sind. Die dritte Studie dieser Arbeit lieferte den empirischen Beweis, dass der entwicklungsgesteuerte Prozess der Chlamydosporen-Keimung bei Foc TR4 eisenabhängig ist. Im Rasterelektronenmikroskop zeigte sich, dass Chlamydosporen unter Eisenmangel keinen Keimschlauch bilden und eine reduzierte metabolische Aktivität aufweisen. Außerdem weist die Keimung eine Plastizität hinsichtlich des extrazellulären pH-Wertes auf, wobei mehr als 50% der Keimungen zwischen pH 3 und pH 11 erfolgten. Dies deutet darauf hin, dass die Krankheitsunterdrückung durch die Manipulation des Boden-pH-Wertes nicht notwendigerweise durch Veränderung der Bioverfügbarkeit von Eisen erfolgt. Der Bedarf an Eisen wurde anhand der Expression zweier Gene (rnr1 und rnr2) weiter untersucht. Diese Gene kodieren die Ribonukleotid-Reduktase (RNR), d.h. das Enzym, welches das Zellwachstum durch DNA-Synthese kontrolliert. Die Expression von rnr2 wurde bei Chlamydosporen unter Eisenmangel signifikant stärker induziert als in der Kontrolle. Die vierte Studie dieser Arbeit untersuchte die Produktion mikrobieller, eisen-absondernden Metaboliten (Siderophoren) als möglichen Mechanismus, der dem Eisenmangel entgegenwirkt. Es wurde im Speziellen gezeigt, dass Ferrichrom, eine Hydroxamat-Siderophore, ausschließlich im Mycel von Kulturen mit Eisenmangel synthestisiert wurde und somit eine de novo Biosysnthese nahelegt. Darüber hinaus wurden auch Aminosäure-Vorstufen für die Siderophoren-Biosynthese (Ornithin, Arginin) durch Eisenmangel verändert. Insgesamt erweitert diese Doktorarbeit das grundlegende Verständnis der Biologie und Ökologie von Foc TR4 und liefert somit eine Grundlage für die Nutzung des Potenzials zur Manipulation der Rhizosphäre für das Management der Fusarium-Welke.