Investigating the mode of action of the mycoherbicide component Fusarium oxysporum f.sp. strigae on Striga parasitizing sorghum and its implication for Striga control in Africa

Amongst the factors that are a threat to food security in Africa, is the parasitic weed Striga hermonthica which affects mostly cereals that constitute the staple food for subsistence farmers, thus affecting the livelihood of millions of people. Popularly known as witchweed, attack due to S. hermonthica can completely destroy the yield of cereal crops. Efforts to combat Striga have had very limited success since farmers rarely adopt control methods due to the mismatch between technologies and farmers? socio-economic conditions. Being such a severe problem, an appropriated method for Striga management adapted for African farmers is very much needed. The use of soil-borne fungi for biocontrol is now being developed as an alternative to the use of chemicals considering the specificity of such fungi and the fact that most of the damage by Striga is done before its emergence. The fungus Fusarium oxysporum f.sp. strigae has been identified and shown to be effective and specific to S. hermonthica and S. asiatica but its mode of action is not yet well known. It is required that the mechanisms underlying the mycoparasitic process of this natural antagonistic agent be well understood before its use. Thus, studies on the effectiveness, specificity and timely colonization of Foxy 2 on S. hermonthica are necessary as well as studies on the effect of Foxy 2 in Striga-host plants which should demonstrate its non-pathogenicity to food crops. The objective of this study was therefore to investigate the mode of action of Foxy 2 in its target S. hermonthica and non-target Sorghum bicolor and also to examine the safety of the use of this mycoherbicide by evaluating its ability to produce toxins. In the first part of the thesis, the ability of Foxy 2 to colonize sorghum roots and possibly shoots was investigated using light and transmission electron microscopy. The efficacy of Foxy 2 to cause death of S. hermonthica seedlings attached to Foxy 2 colonized sorghum roots was also evaluated. Microscopic investigations revealed that the intensity of root colonization by Foxy 2 increased with time and Foxy 2 could survive and colonize the sorghum rhizodermis, root hairs and cortical parenchyma up to four weeks after sowing. This behaviour is well adapted for Striga control as it corresponds to the peak of Striga seedling attachment. Hyphae were completely absent from the sorghum root central cylinder even after four weeks and also absent from the sorghum shoots up to 11 weeks after sowing indicating the non-pathogenity of Foxy 2 to sorghum. Furthermore, Foxy 2 was effective in controlling S. hermonthica by causing disease in 95% and 86% of S. hermonthica seedlings when coated on seeds of tolerant and susceptible sorghum cultivars respectively. Therefore, Foxy 2 could be combined with the tolerant sorghum variety in an integrated approach against S. hermonthica and S. asiatica. The effect of Foxy 2 on various growth stages of S. hermonthica was investigated subsequently so as to understand the mechanisms of action of Foxy 2 within S. hermonthica in the real living complex between the mycoherbicide Foxy 2, the parasite S. hermonthica and its host sorghum. Light, scanning and transmission electron microscopy were used to evaluate the pattern of colonization and control of S. hermonthica seedlings and shoots by Foxy 2. Results showed that 26 days after sowing Foxy 2 coated sorghum seeds, all tissues of the young S. hermonthica seedlings attached to sorghum roots were completely degraded and destroyed by Foxy 2 including the haustorial intrusive cells, hyaline tissue, vessels, central xylem elements and Striga cortical parenchyma. Some S. hermonthica plants which attached to areas of the sorghum root which were not yet colonized by Foxy 2 (towards the root tips), were able to outgrow the fungus and emerged. In the emerged S. hermonthica shoots, hyphae had subsequently penetrated and colonized vessels clogging them over long distances and were identified up to the top of the plants. In some vessels there was an intensive blockage of the vessels by hyphae such that spaces or gaps were rare. Ultrathin sections showed that the diseased S. hermonthica shoots reacted to Foxy 2 invasion by forming an electron dense wall coating along the secondary vessel walls probably to prevent fungal digestion of the walls. The study thus identified two mechanisms by which Foxy 2 contributed to wilting and death of S. hermonthica which included complete digestion of underground S. hermonthica seedlings and hyphal clogging of vessels in emerged S. hermonthica plants which interfered with water conduction. In order to understand the reactions of sorghum towards the presence of Foxy 2 as part of the risk assessment to ensure the safe use of this biocontrol agent, the action of Foxy 2 and a known pathogenic Fusarium species, F. proliferation, were compared in the fourth chapter. Sorghum roots were also wounded to expose the vascular system so as to investigate whether removal of the endodermal barrier could give access to Foxy 2 into the vessels which could lead to digestion resulting in wilting of the sorghum plants. The colonization processes of the two Fusaria species were quite different at all stages of growth. While F. proliferatum degraded the endodermis, invaded the central cylinder and digested the xylem parenchyma two weeks after sowing, Foxy 2 was restricted to the cortex even up to four weeks after sowing. Hyphae of Foxy 2 filled the intercellular spaces at the outer endodermal wall but could not penetrate the endodermis. Sorghum roots were observed to react to Foxy 2 invasion by reinforcing the central cylinder as seen by an increase in blue auto fluorescence especially of the endodermis. Five days after wounding and inoculating sorghum roots, Foxy 2 hyphae invaded the central cylinder very close to the cut but were completely absent from the central cylinder at a distance of 3000 µm from the cut, meanwhile F. proliferatum hyphae had digested the cells of the central cylinder at this distance. This indicated that not only the endodermis was a barrier but there could also be a physiological barrier within the central cylinder of the sorghum root which did not allow further spread of Foxy 2. Hence, exposure of the vascular system did not serve as a route for the invasion of Foxy 2 which therefore implied that it could not cause wilting of the plant. In the last part of the thesis, S. hermonthica shoots were analyzed by HPLC-MS/MS to investigate the possible production of toxins by Foxy 2 to kill the plant. Amongst the toxins tested (beauvericin, fumonisins B1, B2, B3, C and P series, enniatins A, A1, B and B1, and moniliformin), only beauvericin (BEA) was detected to be produced by Foxy 2 in S. hermonthica shoots. The concentration of this toxin increased with increased infection e.g. 60 µg BEA/kg Striga shoot tissue (dry weight) were detected three weeks after emergence rising to 720 µg BEA/kg Striga shoot tissue after six weeks in the severely diseased S. hermonthica shoots. When beauvericin was applied on S. hermonthica shoots at concentrations of 50 µM, transmission electron microscopy showed that all cell types became necrotic. However, beauvericin as well as all the other toxins were not detected in sorghum grains harvested from sorghum plants which were hosts to the S. hermonthica plants and growing from Foxy 2 coated sorghum seeds. Given that some F. oxysporum strains were previously shown to be able to produce fumonisins which are among the toxins which have been reported to be of potential risks to human and animal health, a pure culture of Foxy 2 was evaluated for its fumonisin production ability. Results from real-time PCR using two specific primer pairs for the FUM1 gene (which is the key gene for fumonisin synthesis), were negative confirming that Foxy 2 was not able to produce fumonisins and might not be of major concern for human and animal health when used as a biocontrol agent in the field, therefore safe for use as a biocontrol agent. To conclude, Foxy 2 showed potential to control S. hermonthica by completely destroying young underground stages and clogging vessels in aboveground stages, as well as producing the toxin beauvericin, both actions contributing to wilting of the plants. Its non-pathogenicity to sorghum and its inability to produce fumonisins could be seen as factors which make it well suited as a biocontrol agent. Further research needs to be done to evaluate its efficacy under field conditions and the impact of naturally occurring soil microorganisms and abiotic conditions on performance of Foxy 2 so as to understand its interactions with the environment and to optimize its efficacy.

Zu den Faktoren, die die Nahrungssicherung in Afrika bedrohen, gehört das parasitische Unkraut Striga hermonthica, das speziell das Getreide der Landwirte schädigt, die in Subsistenzwirtschaft leben. Somit wird der Lebensunterhalt von Millionen Menschen negativ beeinflusst. Bei einem starken Befall kann das Unkraut S. hermonthica, auch ?witchweed? genannt, zum vollständigen Getreideertragsverlust führen. Bemühungen Striga zu bekämpfen, hatten bisher sehr begrenzten Erfolg, da die Landwirte selten die geeigneten Bekämpfungsmethoden anwenden können, da solche Technologien mit den Sozioökonomischen Umständen der Landwirte oft nicht vereinbar sind. Daher ist eine für einen afrikanischen Bauern geeignete Methode für Striga-Management notwendig. Angesichts des Lebenszyklus von S. hermonthica bietet sich die Anwendung pathogener Pilze als Alternative zur Anwendung von Chemikalien an. Dafür sprechen die Wirtsspezifität solcher Pilzarten sowie die Tatsache, dass ein Großteil der Schädigung durch Striga bereits vor dem Auflaufen erfolgt. Zwar wurde der Pilz F. oxysporum f.sp. strigae identifiziert und als wirksam und spezifisch für S. hermonthica charakterisiert, aber die Mechanismen seiner Vorgehensweise und Wirkung sind noch weitgehend unbekannt. Es ist für die Anwendung notwendig, die dem mykoparasitischen Prozess zugrundeliegenden Mechanismen eines natürlich entgegenwirkenden Erregers zu verstehen. Daher sind Studien zur Wirksamkeit, Spezifizität und spontanen Kolonisation von Foxy 2 auf S. hermonthica, sowie Untersuchungen zur pathogenen Wirkung von Foxy 2 auf Striga-Wirtspflanzen notwendig. Ziel dieser Studie war daher das Verhalten von Foxy 2 auf S. hermonthica und Sorghum bicolor zu untersuchen, aber auch die Sicherheit bei der Anwendung dieses Mykoherbizides zu erforschen, in dem die Fähigkeit zur Toxinproduktion bewertet wird. Im ersten Teil (Kapitel II) wurde die Fähigkeit von Foxy 2 Sorghumwurzeln und möglicherweise Sprosse zu kolonisieren mit Hilfe von Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Ebenso wurde die Wirksamkeit von Foxy 2 bewertet, mit der es zu einem Absterben von S. hermonthica Jungpflanzen kommt, welche Sorghumwurzeln befallen die mit Foxy 2 kolonisiert wurden. Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass sich die Intensität der Wurzelkolonisation durch Foxy 2 mit der Zeit erhöhte und Foxy 2 dabei noch bis vier Wochen nach dem Säen überleben konnte und Sorghum-Rhizodermis, Wurzelhaare und kortische Parenchyme kolonisieren konnte. Dies ist von Vorteil bei der Bekämpfung von Striga, da dieser Zeitpunkt dem Höhepunkt im Befall durch Striga Jungpflanzen entspricht. Hyphen waren auch noch vier Wochen nach der Saat im Zentralzylinder der Sorghumwurzel und bis zu 11 Wochen nach der Saat im Sorghum Schössling nicht vorhanden. Dies weist darauf hin dass Foxy 2 gegenüber Sorghum kein Pathogen darstellt. Darüber hinaus war Foxy 2 effektiv bei der Bekämpfung von S. hermonthica, da es bei 95% bzw. 86% der Jungpflanzen von S. hermonthica Erkrankungen verursachte, wenn das Saatgut von toleranten bzw. anfälligen Sorghum Sorten mit Foxy 2 umhüllt wurde. Foxy 2 kann daher mit der toleranten Sorte von Sorghum in einem integrierten Ansatz gegen Striga kombiniert werden. Die Wirkung von Foxy 2 auf unterschiedliche Wachstumsphasen von S. hermonthica wurde im zweiten Teil untersucht, um das Verständnis der Verhaltensmechanismen von Foxy 2 innerhalb des lebenden Systems zwischen dem Mykoherbizid Foxy 2, dem Parasit S. hermonthica und seinem Wirt Sorghum zu verbessern. Licht-, Scan- und Transmissionselektronenmikroskopie wurden verwendet, um die Art des Befalls und den Einfluss auf Keimlinge und Schösslinge von S. hermonthica durch Foxy 2 zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Gewebe der Jungpflanzen von S. hermonthica (an Sorghumwurzeln) 26 Tagen nach der Aussaat von mit Foxy 2 umhülltem Saatgut vollständig abgeschwächt und zerstört wurden, einschliesslich der intrusiven Zellen, den Haustorien der Hyalingewebe, der Gefäße der Zentralxylemelemente und des Rindenparenchyms. Einige Pflanzen von S. hermonthica, die sich in der Umgebung der Wurzelspitzen von noch nicht mit Foxy 2 kolonisierten Sorghumwurzeln angeheftet hatten, konnten dem Pilz entwachsen und sich entwickeln. In einigen Gefäßen solcher Strigapflanzen war eine intensive massenhafte Hyphenbesiedelung zu finden, die über weite Strecken das Leitsystem der Sprösslinge bis in die Sprossspitzen fast vollständig verstopften und zur Welke der Schösslinge beitrugen. Ultradünnschnitte zeigten, dass die erkrankten Schösslinge von S. hermonthica auf den Eingriff von Foxy 2 reagiert haben indem sie eine elektronendichte Wand (wahrscheinlich zur Vermeidung einer Zersetzung der Wände durch den Pilz) entlang der sekundären Gefäße bildeten. Die Studie identifizierte daher zwei Mechanismen wodurch Foxy 2 zum Welken und Absterben von S. hermonthica beigetragen hat. Zum einen die komplette Zersetzung der noch unterirdischen Keimlinge von S. hermonthica und zum anderen die durch Hyphenbefall der Gefäße gestörte Wasserversorgung von S. hermonthica. Zur Risikobewertung dieser Pflanzenschutzanwendung wurde im vierten Kapitel die Reaktion von Sorghum auf die Anwensenheit von Foxy 2 untersucht, in dem das Verhalten von Foxy 2 mit dem eines bekannten Fusarium Pathogens, F. proliferatum verglichen wurde. Zudem wurde an Sorghumwurzeln, bei denen das Gefäßsystem freigelegt wurde untersucht, ob die Entfernung der Endodermisbarierre das Eindringen von Foxy 2 in die Gefäße erleichtert, so dass eine Zersetzung stattfindet die zum Welken der Sorghumpflanze führt. Die Infektionsprozesse beider Pilzarten unterschieden sich in allen Wachstumsphasen grundlegend. Während F. proliferatum das Endoderm zersetzte, in den Zentralzylinder eindrang und das Xylem-Parenchym zwei Wochen nach dem Säen zersetze verblieb Foxy 2 bis zu vier Wochen nach der Aussaat in der Rinde. Hier verblieben die Hyphen von Foxy 2 in den Interzellularräumen außerhalb der Endodermis, während die Sorghumwurzeln mit einer Verstärkung des Zentralzylinders auf das Eindringen von Foxy 2 reagierten, wie durch den Anstieg der Autofloureszenz der Endodermis im blauen Bereich gezeigt werden konnte. Fünf Tage nach einer artifiziellen Infektion und der Inokulation der Sorghumwurzel haben Foxy 2 Hyphen den Zentralzylinder nahe dem Auschnitt befallen, waren jedoch in einer Entfernung von 3000 µm im Zentralzylinder nicht nachzuweisen, wohingegen F. proliferatum-Hyphen die Zellen des Zentralzylinders bis zu dieser Entfernung bereits zersetzt hatten. Dies zeigt, dass nicht nur die Endodermis eine Barriere darstellte, sondern auch eine physiologische Barriere innerhalb des Zentralzylinders der Wurzel existieren könnte, die eine weitere Ausbreitung von Foxy 2 verhinderte. Deshalb konnte das freigelegte Gefäßsystem von Foxy 2 nicht als Infektionsweg genutzt werden, was zur Folge hatte dass die infizierte SorghumPflanze kein Welken zeigte. Im letzten Teil der Arbeit wurde mithilfe der HPLC-MS/MS Schösslinge von S. hermonthica auf eine mögliche Produktion von Toxinen durch Foxy 2 untersucht, die zum Absterben der Wirtspflanzen führen könnten. Bei den untersuchten Toxinen (Beauvericin, Fumonisine der B1, B2, B3, C und P Serie, Enniatin A, A1, B und B1, und Moniliformin) wurde festgestellt, dass Beauvericin in den Schösslingen von S. hermonthica von Foxy 2 produziert wurde. Die Konzentration dieses Toxins stieg mit steigender Infektionsintensität. So wurden drei Wochen nach dem Auflaufen der Striga Sprosse 60 µg BEA/kg Trochengewicht festgestellt, nach sechs Wochen in den schwer geschädigten Schösslingen dagegen 720 µg BEA/kg Trochengewicht. Als Gaben von Beauvericin in Konzentrationen von 50 µM auf die Schösslinge von S. hermonthica untersucht wurden, zeigte sich im transmissionselektronenmikroskopischen Befund, dass alle Zellarten nekrotisch waren. Weder Beauvericin noch die anderen Toxine wurden in den geernteten Getreidekörnen, welches von Sorghum Pflanzen stammt, die von S. hermonthica befallen waren und welche aus mit Foxy 2 umhüllten Saatgut angezogen wurden, festgestellt. Da Fumonisin zu den für Menschen und Tiere gesundheitschädlichsten Toxinen gezählt wird, wurden Reinkulturen von Foxy 2 auf die Fähigkeit zur Fumonisinproduktion getestet, indem die PCR-Methode untersucht wurde, ob das wichtigste Gen der Fumonisinsynthese (FUM1) anwesend war. Die Anwendung von zwei spezifischen Primerpaaren zeigte negative Ergebnisse so, dass gefolgert wurde, dass Foxy 2 Fumonisin nicht produzieren kann, und daher als ungefährlich im Einsatz als Pflanzenschutzmittel angesehen wird. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Foxy 2 das Potenzial hat den Befall durch S. hermonthica zu kontrollieren, indem es die jungen noch unterirdischen Pflanzen völlig zerstört und in den oberirdischen Pflanzen die Gefäße verstopft, wo auch das Toxin Beauvericin produziert wird. Beides führt zum Welken der Pflanze. Aufgrund der fehlenden Pathogenität gegenüber Sorghum, sowie der fehlenden Möglichkeit Fumonisin zu produzieren, kann Foxy 2 als geeignetes Pflanzenschutzmittel angesehen werden. Weitergehende Untersuchungen müssen die Eignung von Foxy 2 unter dem Einfluss natürlicher Bodenmikroorganismen und abiotischen Faktoren im Freiland zeigen, um die Interaktion mit der Umwelt zu verstehen und die Wirkung zu optimieren.