Extracellular proteins from lignocellulose degrading Basidiomycetes: Redox enzymes from Trametes versicolor and Coprinopsis cinerea

Das extrazelluläre Proteom bei Pilzen besteht aus drei Fraktionen: frei ins Medium ausgeschiedene Proteine, Proteine in der äußeren Schleimschicht der Hyphe und Zellwandproteine. Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von sekretierten Enzymen von holzabbauenden Basidiomyzeten einschließlich zellwandgebundenen Redox-Enzymen, insbesondere Laccasen, wurden etabliert bzw. optimiert. Bei Askomyzeten beschriebene Methoden zur Aufarbeitung von Zellwänden ließen sich bei Trametes versicolor nicht anwenden. Zerreiben von Myzel in einer Schwingmühle mit einer Stahlkugel ergab reine Zellwände ohne Kontaminationen von zytoplasmischen Enzymen. Von Zellwänden isolierte Gesamtproteine lassen sich wie Proteine aus Kulturüberständen in 1D- und 2D-Elektrophorese analysieren und die Methode der Zellwandaufreinigung lässt sich auf andere Basidiomyzeten übertragen. Generell unterscheiden sich bei T. versicolor die drei Fraktionen von sekretierten Proteinen deutlich in Ladung und Größe. Von sieben Spots in 2D-Gelen des Kulturüberstandes wurden durch ESI-LC-MS-Analyse Peroxidasen und Laccase identifiziert, 90 andere Spots blieben unidentifiziert aufgrund fehlender Sequenzdaten. In 1D- und 2D-Gelelektrophorese mit verschiedensten bekannten und neuen Substraten (allein, mit Co-Substraten und in Kombinationen) wurde das ins Medium ausgeschiedene Proteom von T. versicolor und Coprinopsis cinerea und auch das Zellwand-verbundene Proteom von T. versicolor auf Phenoloxidaseaktivitäten untersucht. Die Kombination TMA (N,N,N´,N´-Tetramethyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid) und alpha-Naphthol war am intensivsten im Erkennen von Phenoloxidaseaktivitäten, MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochloridmonohydrat) mit DHPPA (3,4-Dihydroxyhydrozimtsäure) ergab die schärfsten und stabilsten Banden und Spots in Gelen. Laccasen von T. versicolor and C. cinerea konnten durch ESI-LC-MS-Analysen in Banden identifiziert werden. Laccasen in T. versicolor Zellwänden wurden durch Behandlung mit verschiedenen lytischen Enzymen aus ihnen herausgelöst, in nativer PAGE aufgetrennt, und enzymgefärbt. Durch ESI-LC-MS-Analysen von auftretenden Banden konnte Laccase III identifiziert werden neben einer Pyranoseoxidase. Laccase III ist auch in hohen Konzentrationen in Kulturüberständen von T. versicolor nach Induktion durch 2,5-Xylidin vorhanden. Aufgereinigtes Enzym wurde in seinen Eigenschaften mit denen von Zellwand-gebundenen Laccaseaktivität verglichen. pH-Optima waren unterschiedlich und Stabilitäten in hohen Temperaturen und gegenüber Enzyminhibitoren sind bei gebundenen Enzymen besser.

The extracellular proteome of fungi consists of three different fractions: proteins secreted freely into the medium, the hyphal sheath proteins, and cell wall-associated proteins. Methods for isolation and characterization of secreted enzymes from wood degrading Basidiomycetes were established and/or optimized, including methods for isolation and characterization of cell wall-bound redox enzymes, in particular laccases. Methods established on Ascomycetes were not applicable for the processing of cell walls of the Basidiomycete Trametes versicolor. Grinding of the mycelia in a ball mill with a steel ball resulted in pure cell walls without contamination with cytoplasmic enzymes and the method of the cell wall purification can be transferred to other Basidiomycetes. Proteins isolated from isolated cell walls can be analyzed in 1D- and 2D-electrophoresis just like proteins from a culture supernatant. Fractions of proteins from the hyphal sheath, fractions of cell wall-associated proteins, and fractions of proteins from culture supernatants of T. versicolor differ in charge and size. From 2-D gels of T. versicolor supernatant proteins, seven spots were identified by ESI-LC-MS analysis to represent peroxidases and laccases, respectively. However, the identity of 90 other spots remained unidentified due to missing sequence data. Upon 1D- and 2D-gel electrophoresis, the secreted proteome of T. versicolor and Coprinopsis cinerea as well as cell wall-bound proteins from T. versicolor were analyzed for phenoloxidase activities using several known as well as some new enzyme substrates (alone, with co-substrates and in combinations). While the combination TMA (N,N,N´,N´-tetramethyl-1,4-phenyldiammonium dichloride) + alpha-naphthol was most sensitive in detecting phenoloxidase activities in the gels, MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrazone hydrochloride monohydrate) + DHPPA (3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid) resulted in the sharpest and most stable bands and spots. By ESI-LC-MS analysis, some of phenoloxidase-reactive bands were identified to contain laccase of T. versicolor and C. cinerea, respectively. Laccases from T. versicolor were isolated by treating isolated cell walls with different lytic enzymes. Released enzymes were separated by native PAGE and phenoloxidase activities detected by enzymatic staining reactions. By ESI-LC-MS analysis of stained bands, laccase III was identified besides a pyranose oxidase. Laccase III is also present in high concentrations in culture supernatants of T. versicolor after induction by 2,5-xylidine. Laccase from culture supernatants showed different characteristics compared to the cell wall-bound laccase. The supernatant and the cell wall-bound laccases differed in their pH optima and in sensitivity towards high temperatures and the cell wall-bound enzymes were more resistant to enzyme inhibitors than the free laccases.