DNA sequence-based Identification and molecular phylogeni within subfamily Dipterocarpoideae (Dipterocarpaceae)

Die Arten der Familie der Dipterocarpaceaen (Flügelfruchtgewächse) sind in der Region Malesien die Hauptbaumarten in Bezug auf Holzgewinnung. Die geografische Verbreitung der Pflanzenfamilie erstreckt sich bis Südamerika und Afrika. Die Familie umfasst etwa 500 Arten in 17 verschiedenen Gattungen und ist unterteilt in drei Unterfamilien: Dipterocarpoideae, Monotoideae und Pakaraimoideae (Ashton, 1982). Dipterocarpoideae ist mit 470 Arten in 13 Gattungen die artenreichste Unterfamilie (Ashton, 1982). Sie ist noch einmal unterteilt in zwei Triben: Dipterocarpeae und Shoreae. Dipterocarpeae umfasst die Gattungen Anisoptera, Cotylelobium, Dipterocarpus, Stemonoporus, Upuna, Vateria und Vateriopsis, Shoreae die Gattungen Dryobalanops, Hopea, Neobalanocarpus, Parashorea und Shorea. Shorea und Hopea sind mit 169, bzw. 100 Arten die artenreichsten Gattungen. Studien zur molekularen Phylogenie der Unterfamilie Dipterocarpoideae werden bereits seit 1998 durchgeführt, besonders an der Gattung Shorea und ihren Schwestergattungen im Tribus Shoreae, da diese Gattung die höchste Artenzahl aufweist und von allen Dipterocarpaceaen das wertvollste Holz liefert. Viele dieser Arten sind vom Aussterben bedroht. Ziel von Untersuchungen zur molekularen Phylogenie ist die Vervollständigung von Phylogenien, die auf morphologischen Merkmalen beruhen, da die Einordnung von einigen Gattungen im Tribus Dipterocarpoideae noch immer zur Diskussion steht. Die Klassifizierung von Shorea in dieser Untersuchung bezieht sich auf Ashton (1982) und Symington (1943). Symington (1943) unterteilt Shorea basierend auf der Farbe des Holzes (White Meranti, Yellow Meranti, Balau und Red Meranti). Ashton (1982) hat die Klassifizierung von Symington (1943) grundsätzlich beibehalten, aber einige der Gruppen wurden in niedrigere taxonomische Ränge neu klassifiziert. Die Nachfrage nach Identifikationsmöglichkeiten für Dipterocapaceaen zur Vermeidung von Betrug bei der Zertifizierung von Holz hat zu einer Verbesserung moderner Identifikationssysteme geführt, die auch molekulare Daten nutzen. Traditionell werden Dipterocarpaceaen anhand von morphologischen Merkmalen identifiziert. Allerdings ist diese Art der Bestimmung ist oft nur eingeschränkt nutzbar, vor allem wenn keine Blüte vorhanden ist, da dies das eindeutigste taxonomische Bestimmungsmerkmal bei Dipterocarpaceaen ist. Die große Menge molekularer Daten und die fortschrittlichen Technologien im Bereich der DNA-Sequenzierung ermöglichten es dem DNA-Barcoding zu einer weitverbreiteten Technik für verschiedene taxonomische Studien zu werden. Dabei will es die traditionelle Taxonomie nicht ersetzen, sondern ergänzen und den Identifikationsvorgang beschleunigen. Zusätzlich ermöglicht die große Anzahl an verfügbaren Sequenzen in öffentlichen Datenbanken, wie z.B. die NCBI-Datenbank, die Entwicklung eines molekularen taxonomischen Schlüssels, einem neuen Konzept der Artidentifikation. Allerdings sind die Methoden des DNA-Barcoding noch immer in ihren Anfängen, so wird z.B. die Datenbank für das Projekt DNA Barcoding zurzeit noch eingerichtet. Diese Studie hat zum Ziel, mithilfe von vier Chloroplastenregionen (trnL intron, psbC-trnS IGS, matK und rbcL) die phylogenetischen Beziehungen in der Unterfamilie Dipterocarpoideae zu erschließen, sowie die Einordnung der verschiedenen Gattungen. Zusätzlich prüft diese Untersuchung auch die Eignung der beiden Barcoding-Regionen matK und rbcL, die vom Konsortium Barcode of Life (CBOL) im Jahr 2009 vorgeschlagen wurden. Ein weiteres Ziel ist die Entwicklung eines taxonomischen Identifizierungsschlüssels für die Identifizierung von Arten basierend auf der phylogenetischen Analyse. Alle Sequenzen von Dipterocarpaceaen, die in der NCBI-Datenbank hinterlegt sind, wurden für vier Chloroplastenregionen (trnL intron, psbC-trnS IGS, matK und rbcL) abgerufen. Zusätzlich zu den Sequenzen aus der NCBI-Datenbank wurden für die Untersuchung auch Proben sequenziert, die in der Abteilung Forstgenetik und Forstpflanzenzüchtung der Universität Göttingen zur Verfügung standen, um eine höchstmögliche Zahl von unterschiedlichen Arten untersuchen zu können. Für die phylogenetischen Analysen wurde die Software MEGA 5 verwendet und die statistischen Methoden maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) und neighbor joining (NJ). Für die DNA-basierte Identifizierung wurde die Eignung von zwei Barcoding-Regionen mithilfe von nBLAST getestet. Die phylogenetische Analyse wurde unter Verwendung der neighbor joining-Methode durchgeführt. Es war für eine große Anzahl von Arten möglich, Sequenzen von den oben genannten  Chloroplastenregionen zu erhalten: 145 Arten für trnL intron, 117 Arten für psbC-trnS IGS, 116 Arten für matK und 69 Arten für rbcL. Die Länge der Sequenzen für die verschiedenen Regionen variierte, 537 bp, 1136 bp, 653 bp und 647 bp für die Regionen trnL intron, psbC-trnS IGS, matK bzw. rbcL. Die verschiedenen Methoden MP, ML und NJ für die phylogenetischen Analysen erzeugten sehr ähnliche Baumtopologien. Daher basiert die Diskussion vor allem auf den Ergebnisse der MP-Methode. Grundsätzlich war es nicht möglich, die evolutionären Beziehungen der Unterfamilie der Dipterocarpoideae anhand der vier Chloroplastenregionen eindeutig zu entschlüsseln. Die Regionen ermöglichten nur eine Aufklärung der Triben Dipterocarpeae und Shoreae, waren aber innerhalb der Triben deutlich weniger erfolgreich, vor allem in Bezug auf Shoreae. Für die Gattung Dipterocarpus stehen bisher nur Sequenzdaten der Regionen trnL intron und matK zur Verfügung. In dieser Studie wurden für beide Regionen eindeutig abgrenzbare Gruppen von Arten entdeckt. Es wird vermutet, dass Dipterocarpus die basale Gruppe der Dipterocarpoideae repräsentiert (Meijer, 1979). Diese Gattung hat der Familie auch ihren Namen gegeben, möglicherweise weil sie als eine sehr ursprüngliche Gruppe innerhalb der Dipterocarpaceaen gilt (Maury – Lechon, 1979). Auch ist diese Gattung innerhalb der Familie der Dipterocarpaceaen eindeutig definiert, basierend auf morphologischen Merkmalen und molekularen Analysen. Die Analysen der Region psbC-trnS IGS bestätigten die Ergebnisse von Symington (1943) basierend auf der Farbe des Holzes dahingehend, dass die Gattung Shorea eine monophyletische Gruppe bildet. Durch die Analyse der Region matK war es am ehesten möglich, die Beziehungen innerhalb des Tribus Dipterocarpeae zu beschreiben und die Sektion Doona innerhalb der Gattung Shorea als monophyletische Gruppe abzugrenzen. Allerdings war diese Region nicht geeignet für die weitere Klassifizierung innerhalb des Tribus Shoreae. Obwohl die Region rbcL die erste Chloroplastenregion ist, die sequenziert wurde, sind in der NCBI-Datenbank nur wenige Sequenzen verfügbar. Die Ergebnisse basierend auf den eigenen Labordaten führten zu dem Schluss, dass diese Region nicht geeignet ist, um die evolutionären Beziehungen der Dipterocarpoideae unterhalb der Gattungsebene aufzuzeigen. Die Region matK zeigte in dieser Untersuchung eine nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Dryobalanops und Dipterocarpus, während die Region trnL intron eher darauf hindeutete, dass Dryobalanops eine Verwandtschaft zur Sektion Balau aus der Shorea-Gruppe aufweist. Diese gegensätzlichen Ergebnisse unterstützen die Annahme von Indrioko (2005), dass diese Gattung eine basale Gruppe des Tribus Shoreae ist. Die Artidentifizierung basierend auf DNA-Daten wurde anhand von zwei Vorgehensweisen untersucht, DNA-Barcoding und ein molekularer taxonomischer Identifizierungsschlüssel. Die zwei Barcode-Regionen matK und rbcL, übernommen vom Consortium for the Barcode of Life für Landpflanzen (Hollingsworth et al., 2009), wurden auf ihre Eignung als Barcoding-Regionen für die Unterscheidung der Dipterocarpaceae geprüft. Die meisten benötigten Informationen für die Region matK waren in der NCBI-Datenbank vorhanden, aber es wurden auch einige zusätzliche Proben in dieser Studie verwendet. Insgesamt wurden 119 bzw. 67 Proben für die Untersuchung der Region matK bzw. rbcL, verwendet. Für die Beurteilung der Effektivität der Barcoding-Analyse in dieser Untersuchung wurden zunächst mithilfe von neighbor joining-Bäumen monophyletische Gruppen einmal für die Eingabesequenzen und einmal für die Referenzsequenzen, die in der NCBI-Datenbank hinterlegt sind, identifiziert. Unter Verwendung von nBLAST wurde dann nach Ähnlichkeiten zwischen den Eingabesequenzen aus dem Labor und den Sequenzen aus der NCBI-Datenbank gesucht. Obwohl der neighbor joining-Baum einige der Sequenzen in die korrekte Gattung eingeordnet hat, konnte diese Region keine drei klar abgetrennten Gruppen für die Gattungen Shorea, Hopea und Parashorea erstellen. Die nBLAST-Analyse ergab für die meisten Eingabesequenzen auf der Artebene eine falsche Identifizierung. Aufgrund der fehlenden Unterscheidung zwischen Arten durch die Region matK, was nicht nur durch die Ergebnisse des nBLAST, sondern auch durch die phylogenetische Analyse deutlich wurde, und der Probleme bei der Amplifizierung ist diese Region ungeeignet als Barcoding-Region für die Familie der Dipterocarpaceaen. Über die Region rbcL kann keine weitere Aussage gemacht werden, da nur wenige Sequenzen für diese Region in der Datenbank verfügbar waren. Allerdings konnte die neighbor joining-Analyse zeigen, dass diese Region erfolgreich auf der Gattungsebene unterscheidet, aber nicht auf der Artebene.  Das DNA-basierte Identifizierungsverfahren unter der Verwendung eines taxonomischen Identifizierungsschlüssels kann noch nicht ausreichend zwischen Arten unterscheiden. Viele verschiedene Arten mit dem gleichen Haplotypen wurden bei der Erstellung des Schlüssels gefunden. Ein möglicher Grund ist die Verwendung der Region trnL intron für die Erstellung des Schlüssels. Taberlet (2007) berichtet, dass diese Region nicht effektiv ist bei der Unterscheidung zwischen nah verwandten Arten.

Dipterocarpaceae is the main timber family of tropical forest trees in the Malesian region with a geographical distribution that extends to South America and Africa. The family comprises approximately 500 species in 17 genera and is subdivided into three subfamilies: Dipterocarpoideae, Monotoideae and Pakaraimoideae (Ashton, 1982).  Dipterocarpoideae is the richest in species with a total of 470 species in 13 genera (Ashton, 1982). Dipterocarpoideae is divided into two tribes: Dipterocarpeae and Shoreae. The genera of Dipterocarpeae are Anisoptera, Cotylelobium, Dipterocarpus, Stemonoporus, Upuna, Vateria and Vateriopsis, while those of Shoreae are Dryobalanops, Hopea, Neobalanocarpus, Parashorea and Shorea. Shorea and Hopea contain most species; 169 in the former and 100 in the latter. Molecular phylogenies of the subfamily Dipterocarpoideae have been studied since 1998, especially the genus Shorea and its sister genera in tribe Shoreae, because this genus has the highest number of species and the most valuable timber of the Dipterocarpaceae. Many of these species are endangered. The purpose of molecular phylogenies is to complement phylogenies based on morphology as there is still a debate on the placement of some genera in the tribe Dipterocarpoideae. The classification of Shorea in this research refers to Ashton (1982) and Symington (1943). Symington (1943) has divided Shorea based on wood color (White Meranti, Yellow Meranti, Balau and Red Meranti). Asthon (1982) has generally retained the classification by Symington (1943), but some of the groups were reclassified into lower taxonomical ranks.  The need for identification tools for Dipterocarpacae in order to avoid fraud in certifying the family’s timber has led to an improvement in modern identification systems that use molecular data. Traditionally, Dipterocarpaceae are recognized based on their  morphological characters, but sometimes these characters have constraints, particularly in the absence of a flower, the most useful taxonomic identification character for the dipterocarps.  The abundance of molecular data as well as advanced technologies in DNA sequencing have made DNA barcoding a widely-used practice in many different fields of taxonomic studies, not as a replacement but as a complement to traditional taxonomy and to accelerate the identification process. Another advantage of the large number of sequences available in public data bases as the NCBI database is that it can lead to a new concept of species identification through the development of a molecular taxonomic key. However, since DNA barcoding methods are still in their infancy, the database for DNA barcoding is still being established. This study aims to infer the phylogenetic relationships of the members of the subfamily Dipterocarpoideae and to study the placement of the genera based on four chloroplast regions (trnL intron, psbC-trnS IGS, matK and rbcL). Furthermore, the suitability of the two barcoding regions (matK and rbcL) will be evaluated, which were proposed by the Consortium for the Barcode of Life (CBOL) in 2009. This study also aims to develop a taxonomic identification key based on the phylogenetic analysis for species identification purposes. Dipterocarpacae sequences that were deposited in the NCBI database were retrieved for four chloroplast regions (trnL intron, psbC-trnS IGS, matK and rbcL). In addition to the analysis of the sequences from the NCBI database, we also sequenced samples of dipterocarps available at the section Forest Genetics and Forest Tree Breeding, Georg-August-University Göttingen, at the four chloroplast regions in order to analyze the highest possible number of species.  The phylogenetic analysis was done using MEGA 5 software and the statistical methods of maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) and neighbor joining (NJ). For the DNA-based identification analyses, we evaluated the suitability of the two barcode regions using nBLAST, and performed the phylogenetic analysis using the neighbor joining method.  Our results succeeded in obtaining sequences for various numbers of species for each studied chloroplast region, namely 145 species for the trnL intron, 117 species for the psbC-trnS IGS, 116 species for the matK region and 67 species for the rbcL region. The final length of the sequences varied for each region, 537 bp, 1136 bp, 653 bp and 647 bp for the trnL intron, psbC-trnS IGS, matK and rbcL, respectively.  For the phylogenetic analyses, MP, ML and NJ analyses of cpDNA sequences produced similar tree topologies. As a result, our discussion is mostly based on the results of the MP analysis. Generally, the evolutionary relationships within the subfamily Dipterocarpoideae could not be clearly revealed by the four chloroplast regions. The regions were able to resolve the tribes Dipterocarpeae and Shoreae, but were less successful within the tribes, particularly Shoreae. For the genus Dipterocarpus, recent studies only provide sequence data for the regions trnL intron and matK. We observed two distinct groups comprising species of this genus for both gene regions. There is an assumption that Dipterocarpus may represent the basal clade of Dipterocarpoideae (Meijer, 1979). The name of this family was taken based on this genus, possibly because it is regarded as a primitive group among Dipterocarpaceae’s members (Maury - Lechon, 1979). This genus is well defined in the Dipterocarpaceae family based on morphological characters and molecular analyses.  The psbC-trnS IGS region in this study agreed with previous research by Symington (1943) in its ability to form a monophyletic group based on wood color in the genus Shorea. The matK region showed the best ability to delineate the relationships of the tribe Dipterocarpeae and succeeded in distinguishing section Doona of Shorea as a monophyletic group. However, this region failed to work as well in classifying other members of Shoreae. Despite the rbcL region’s status as the first DNA region to be sequenced from a chloroplast region, there are few rbcL sequences available for dipterocarps in the NCBI database. The results based on the data from the laboratory showed that this region was unable to trace the evolutionary relationship of Dipterocarpoideae below the generic level. The matK region in this study showed that the genus Dryobalanops has an affinity with genus Dipterocarpus, while the trnL intron tree showed that Dryobalanops is close to section Balau of the Shorea group. These contradictory results support the assumption of Indrioko (2005) that this genus is a basal clade of tribe Shoreae. The DNA-based identification was studied using two approaches, namely DNA barcoding and a molecular taxonomic identification key. The two DNA barcode regions, matK and rbcL, adopted from the Consortium for the Barcode of Life for land plants (Hollingsworth et al., 2009), were applied to assess the feasibility of these regions as barcodes to discriminate the Dipterocarpaceae. Most information for the matK region was available in the NCBI database, but additional samples were also included in this study. In total, 119 and 67 samples were studied using the matK and rbcL regions, respectively. The effectiveness of the barcode analysis in this study was assessed by the formation of monophyletic groups of the query sequences and the reference sequences which are deposited in NCBI using neighbor joining trees and then searching for the similarity of the query sequences from the laboratory against the available data in the NCBI database using nBLAST.  Although the neighbor joining tree placed some of the sequences in the correct genus, this region could not clearly separate the genera Shorea, Hopea and Parashorea into one distinct group for each of them. The nBLAST analysis resulted in most of the query sequences leading to misidentification at the species level. Because of the low ability of the matK region for species discrimination, as indicated by nBLAST and phylogenetic analysis, along with the difficulty in amplifying it, makes this region unsuitable as a barcode region for Dipterocarpaceae. Regarding the rbcL region, we could not observe any affiliation of the query sequences from the laboratory since only several sequences of this region are available in the databases. However, based on our neighbor joining analysis, we observed that this region is able to discriminate above the generic level but not the specific level.  DNA-based identification using a taxonomic identification key indicated that the approach is not yet a suitable tool to discriminate species. Many species belonging to the same haplotype were detected when constructing the key. A possible reason for this is the use of the trnL intron region to construct the key. Taberlet et al., (2007) has reported that this region is not effective in distinguishing closely-related species.