Factors Influencing Fruiting Body Initation of Agaricomycetes

Makroskopische vielzellige Fruchtkörper von Agaricomyceten, allgemein einfach auch nur als „Pilze“ bezeichnet, sind die komplexesten Entwicklungsstrukturen, die im Reich der Pilze existieren. Fruchtkörper dienen zur Produktion und Verteilung der sexuellen Sporen, d. h. der meiotischen Basidiosporen. Die Bildung von Fruchtkörpern und Basidiosporen ist kostspielig und muss daher sorgfältig reguliert werden, um in der Natur zum richtigen Zeitpunkt unter den richtigen Umgebungsbedingungen stattzufinden. Diese Arbeit behandelt Faktoren im Prozess der Fruchtkörperbildung. Zuerst werden in dieser Studie Beobachtungen berichtet zur Fruchtkörperentwicklung von Arten der morphologischen Formgruppe von Coprini mit oftmals autolysierenden Fruchtkörpern (Tintlinge, früher bekannt als die jetzt verworfene Familie Coprinaceae) und verwandter Gattungen von nicht autolysierenden dunkelsporigen Psathyrellaceae, sowie von dem Streu abbauenden Pilz Agaricus xanthodermus, von dem schwachen Baumpathogen Schizophyllum commune und von anderen auf dem Gelände des Nordcampus der Universität Göttingen in den Jahren 2012 bis 2016 beobachteten Agaricomyceten. Fruchtkörperbildung bei den sich schnell entwickelnden Coprini erfolgte in verschiedenen Monaten eines Jahres, abgängig von Niederschlag und Temperatur. Coprini fruchteten hauptsächlich in den Herbstmonaten, aber insbesondere Coprinellus-Arten auch im Frühjahr bis Frühsommer. Viele Coprini, wie Coprinus comatus aus der Familie Agaricaceae und diverse Arten der Gattung Coprinopsis, sowie Lacrymaria lacrymabunda und verschiedene Panaeolus- und Psathyrella-Arten aus der Familie der Psathyrellaceae produzierten auf Grünland Fruchtkörper, u.a. einige auch unter einem höheren Stickstoffeintrag durch tierische Fäkalien im Einklang mit einer Einstufung der Pilze als koprophile Arten (Mistpilze) und „ammonia fungi“. Coprinopsis- und Psathyrella-Arten wurden vergleichsweise häufig in frischen Hackschnitzelbetten beobachtet, Arten der Gattung Coprinellus wurden besonders häufig im Zusammenhang mit Massivholz und auch lebenden Bäumen gefunden. Mehrjährige Fruchtkörper von S. commune traten an Zweigen und Ästen offenbar geschwächter Sträucher und Bäume verschiedener Laubbaumarten auf und wurden auf meist noch berindetem Totholz beobachtet. Eine Kolonie von A. xanthodermus fruchtete im Laufe der Jahre wiederholt unter einer Douglasie, wobei im Jahr 2015 wiederholt Infektionen auf Fruchtkörpern auftraten, die durch einen als Hypomyces odoratus identifizierten konidiogenen Ascomyceten verursacht wurden. Mycelien wurden von dem Mykopathogen und aus Fruchtkörpern des Wirtes isoliert. Im Labor wurde gezeigt, dass die mykopathogenen Isolate Fruchtkörper dieses Wirtes und solche anderer Agaricus-Arten befallen, während Fruchtkörper von Pleurotus ostreatus weitgehend resistent waren. Wachsendes und gewachsenes Myzel von A. xanthodermus und P. ostreatus zeigten im Gegensatz zum Myzel von C. cinerea gute Resistenz. Wiederholte Beobachtungen zur Fruchtkörperproduktion in der Natur an verschiedenen Orten ermöglichen erste Rückschlüsse zu Substraten für Wachstum von Pilzenarten und -gattungen, zu Lebenszyklen und zur Regulierung der Fruchtkörper produktion durch Umweltfaktoren. Isolierte Stämme können dann im Labor verwendet werden, um das Pilzverhalten unter definierten Bedingungen zu untersuchen. Eine neue Technik zur sterilen Isolierung von Basidiosporen wird vorgestellt, die von Basidien aus reifen Fruchtkörpern heraus abgeschossen werden. Die Methode nutzt die Anziehung der Sporen durch elektrostatisch aufgeladene Deckel von Kunststoff-Petrischalen. Keimung von Sporen führt dann zu monokaryotischen Mycelien, die zur Bildung eines neuen Dikaryons gepaart werden können. Elterliches dikaryotisches Mycel kann hingegen durch Sezieren von innerem geschützen Hut- und Stielgewebe und Transfer von Gewebestücken auf Medien mit antibakteriellen Verbindungen erhalten werden. Isolierte fertile dikaryotische Mycelien mit zwei Elterngenomen werden im Labor normalerweise für die Erforschung der Fruchtkörperentwicklung benötigt. Nicht verpaarte Monokaryonen sind normalerweise sexuell steril, es sei denn, sie tragen Mutationen, wie beispielsweise in den Kreuzungstypgenen. Eine solche selbstfertile Mutante ist der Stamm AmutBmut des Modellpilzes C. cinerea. Von diesem Stamm wurden in früheren Arbeiten Mutanten mit Defekten in der Fruchtkörperbildung isoliert. Der Defekt in einer solchen Mutante basiert auf einer Missense-Mutation im Gen cfs1 in einem Codon für einen mutmaßlichen Membrananker einer potenziellen Cyclopropan-Fettsäure-Synthase, die für den ersten Schritt der Fruchtkörperbildung essentiell ist. In dieser Arbeit wurde ein bakterieller Essigsäure-pH-Stresstest durch heterologe Expression des Genes in Escherichia coli angewendet, um die enzymatische Funktion zu bestätigen. Obwohl in einigen Versuchsreihen die erhaltenen Ergebnisse die vorhergesagte Funktion unterstützten, scheint der Test jedoch sehr empfindlich gegenüber schwer vermeidbarer Ungenauigkeiten bei der experimentellen Handhabung zu sein. Die mit dem Gen cfs1 erhaltenen Ergebnisse des Testes blieben daher am Ende in der Aussage offen. Proteomanalyse konnte aber zeigen, dass das Protein Cfs1 im E. coli-Stamm BL21 (DE3) erfolgreich überexprimiert wurde und in der Zukunft zur Entwicklung eines zuverlässigeren Funktionstests für das Protein verwendet werden kann. Andere Agaricomyceten mit publizierten Genomen als C. cinerea tragen enenfalls Kopien von cfs-Genen. Diese genetische Situation unterscheidet sich von Genen für Galectine, das sind kleine sekretierte Galactose-bindende Lectine, die bei der Initiierung derFruchtkörper des Stammes AmutBmut exprimiert werden und früher mit einer möglichen Funktion über Lektinbrückenbildung bei der Hyphenaggregation im Fruchten in Verbindung gebracht wurden. Geninventuren anderer sequenzierter Agaricomyceten zeigten, dass nur sehr wenige andere Arten (z. B. Heterobasidion irregulare, Laccaria bicolor) Galectin-Gene tragen. Es wurde daher der Schluss gezogen, dass die Galectin-Gene keine wesentlichen Funktionen bei der Hyphenaggregation bei der Fruchtkörperentwicklung von Agaricomyceten aufweisen können, weiter unterstützt durch Berichte in der Literatur über eine inzwischen etablierte Funktion der C. cinerea-Galectine als Abwehrproteine gegen Nematoden. Ähnliche begrenzte Verteilungen von Genen über jeweils wechselnde wenige nichtverwandte Arten von Agaricomyceten wurden in weiteren Inventuren gefunden für andere kleine sekretierte Proteine (einfache Lektine, membranporenbildende Lektine und membranporenbildende Hämolysine, wobei bei einigen inzwischen ebenfalls auch Abwehrfunktionen nachgewiesen wurden), die zu Beginn oder während der Fruchtkörperbildung von ihren Wirten produziert werden. Auch diese wurden daher dann als nicht essentiel für die Fruchtbildung eingeordent. Weitere Geninventuren in dieser Arbeit wurden für Gene im Thiamin (Vitamin B1) - Biosyntheseweg von Agaricomyceten durchgeführt. Die meisten Arten von Agaricomyceten sind Thiamin-Auxotrophe, was auf den Verlust des thi5-Gens für die HMP (Hydroxymethylpyrimidin)-Phosphatsynthase zurückzuführen ist. Der Verlust von thi5 erklärt Literaturberichte, warum Zugabe von Thiamin zu Wachstumsmedien die Fruchtkörperbildung von S. commune verbessern kann. In eigenen Experimenten verbesserte die Zugabe von Thiamin zu Wachstumsmedien von C. cinerea die Myzelwachstumsgeschwindigkeit, insbesondere auf dem definierten Basidiomyceten-Standardmedium (BSM), und verbesserte möglicherweise auch die Frequenz des Fruchtens des Pilzes auf YMG/T-Vollmedium. Weitere Arbeiten über Auswirkungen von Thiamin auf Wachstum und Fruchten sollten in der Zukunft zur weiteren Klärung durchgeführt werden.

Macroscopic multicellular fruiting bodies of Agaricomycetes, commonly referred to as mushrooms, are the most complex developmental structures which exist in the kingdom of fungi. Fruiting bodies serve in production and distribution of the sexual spores, i.e. of the meiotic basidiospores. Fruiting body and basidiospore formation is a costly process and must thus thoroughly be regulated in order to occur in nature at the right time under the correct environmental conditions. Factors which determine the fruiting process are addressed in this study. In this study, observations are reported on fruiting body development of species of the frequently fruiting-body-autolysing morphological form group of Coprini (inkcaps, formerly known as the now rejected family Coprinaceae) and of related genera of non-autolysing dark spored Psathyrellaceae, the litter decay fungus Agaricus xanthodermus, the weak tree pathogen Schizophyllum commune and other Agaricomycetes on the grounds of the North Campus of the University of Göttingen in 2012 to 2016. Fruiting of the fast growing Coprini occurred at several different months in the year under control of rainfall and temperature,mainly in the autumn months, but especially for Coprinellus species also in spring to early summer. Many of the Coprini, such as Coprinus comatus from the Agaricaceae and many species of the genus Coprinopsis, as well as Lacrymaria lacrymabunda and various Panaeolus and Psathyrella species from the Psathyrellaceae fruited on grassland, even under higher nitrogen input by animal feces in accordance to ecological descriptions of fungi as coprophilous species (dung fungi) and ammonia fungi. Coprinopsis and Psathyrella species were comparably often observed in fresh wood chip beds and species of the genus Coprinellus were particularly often interlinked with solid wood and also living trees. Perennial fruiting bodies of S. commune occurred on twigs and branches of likely weakened shrubs and trees of various broadleaf species and they was observed on mostly still barked deadwood. A colony of A. xanthodermus fruited repeatedly over the years underneath a Douglas fir with, in the year 2015, mushroom flushes with infections caused by a conidiogenous ascomycete identified as Hypomyces odoratus. Mycelia were isolated from the mycopathogen and from collected host fruiting bodies. The mycopathogens were shown in the laboratory to attack host mushrooms and those of other Agaricus species while fruiting bodies of Pleurotus ostreatus were largely resistant. Growing and grown mycelium of A. xanthodermus and of P. ostreatus showed degrees of resistancy, unlike mycelium of C. cinerea. Repeated observations on fruiting body production in nature on several distinct places allow for fungal species and genera crude deductions on growth substrates, life styles and also environmental regulation of fruiting body production. Isolated strains in the laboratory can be used to address fungal behavior under defined conditions. A new technique is presented for sterile isolation of basidiospores propelled off at maturity from basidia out of fruiting bodies. It makes use of their attraction to electrostatic charged lids of plastic Petri dishes. Germination of spores leads to monokaryotic mycelia which can be mated for the formation of a new dikaryon whereas parental dikaryotic mycelium can be obtained by dissection of protected inner cap and stipe tissues and tissue transfer onto media with antibacterial compounds. Isolated fertile dikaryotic mycelia with two parental genomes are usually needed in the laboratory for research on fruiting body development. Unmated monokaryons are usually sexually sterile unless they carry mutations, for example, in the mating type loci. One of such self-fertile mutants is strain AmutBmut of the model fungus C. cinerea. The strain has previously been further mutated for isolation of mutants with defects in fruiting body formation. A specific defect in the first step of fruiting body formation in one of such mutants was reported to be caused by a missense mutation in the essential gene cfs1 in a codon for a putative membrane anchor of a potential cyclopropane fatty acid synthase. In this study, a bacterial acid pH stress test by heterologous gene expression in Escherichia coli was applied to confirm the enzymatic function. However, the test appears to be very sensitive to inaccuracies in experimental handling difficult to avoid although in some experimental series the results supported the predicted function. Results obtained on gene cfs1 remained therefore in the end still unclear. Proteomics analysis proofed that protein Cfs1 was successfully overexpressed in E. coli strain BL21(DE3) which in the future might be used in development of a more reliable functional test for the protein. Other Agaricomycetes with published genomes as C. cinerea carry copies of cfs genes. This genetic situation is different from genes for galectins, small secreted galactose-binding lectins expressed at fruiting body initiation of strain AmutBmut and implicated earlier to confer lectin-bridging in hyphal aggregation. Gene inventories of other sequenced Agaricomycetes revealed that very few other species (e.g. Heterobasidion irregulare, Laccaria bicolor) carry any galectin genes. It was therefore concluded that the galectin genes cannot present essential functions in hyphal aggregation in fruiting body development of Agaricomycetes, in accordance to a meanwhile established function as defense proteins against nematodes presented in the literature of the C. cinerea galectins. Similar restricted distributions of genes were observed variably over some unrelated species of Agaricomycetes from gene inventories for other small secreted proteins (simple lectins, membrane pore-forming lectins and membrane pore-forming hemolysins, some of which are in the meantime also proven to have defense functions) that were reported previously in the literature to be expressed in individual species at initiation or during fruiting. Also these were then considered as non-essential for fruiting. Further gene inventories are presented in this study for genes in the thiamin (vitamin B1) biosynthesis pathway of Agaricomycetes. Most species of the Agaricomycetes are thiamin-auxotrophs which is due to the loss of the thi5 gene for HMP (hydroxymethyl pyrimidine) phosphate synthase. Loss of thi5 explains why supplementation of thiamin to media can enhance the fruiting body formation of S. commune as reported in the literature. In own first experiments, addition of thiamin to growth media of C. cinerea enhanced mycelial growth speed in particular in the defined basidiomycete standard medium (BSM) and may have positively also affected fruiting frequencies in YMG/T complete medium. Analyses of effects of thiamin on growth and fruiting deserve more work in the future.

2021-11-22