Physiological, morphological and molecular acclimation of Populus spp. to high salinity

Die Versalzung von Ackerland wird immer mehr zum Problem für den Anbau von land- und forstwirtschaftlich genutzten Pflanzen. Erhöhter Salzgehalt im Boden führt zu der Anreicherung toxischer Natrium Ionen im Zellinneren, was ultimativ zum Tod der Pflanze führen kann. Darüber hinaus behindert eine hohe intrazelluläre Natrium-Konzentration die Aufnahme anderer lebenswichtiger Makronährstoffe wie Kalium, Magnesium und Kalzium. Wie genau Natrium bei der Translokation dieser Nährstoffe aus den Wurzeln in den Spross interferiert ist jedoch noch nicht erforscht. Um Salztoleranz auszubilden sind diverse Anpassungen auf molekularer, physiologischer und anatomischer Ebene nötig. Von salztoleranten Pflanzen, auch Halophyten genannt, weiß man, dass sie sukkulente Gewebe ausbilden können. Die Zellen in solchen Geweben sind größer, wodurch das Zell-Lumen und damit der Wasseranteil in den Zellen erhöht wird um die Konzentration an schädlichem Natrium zu verdünnen. Neben den Halophyten, die auf salzige Standorte spezialisiert sind, gibt es auch andere Pflanzen, die erhöhten Salzkonzentrationen standhalten, wie z.B. Populus euphratica, die Euphrat Pappel. Warum P. euphratica jedoch verglichen mit anderen Pappel Arten eine höhere Salztoleranz zeigt, ist noch nicht verstanden. In meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, welche Mechanismen die salztolerante Pappel Art Populus euphratica verwendet um höhere Salzgehalte zu tolerieren und wie die nicht-salztolerante Art Populus x canescens auf erhöhte Salzkonzentrationen reagiert. Dabei habe ich das Augenmerk auf folgende Schwerpunkte gelegt: (i) Die spezielle Wurzelmorphologie von P. euphratica Wurzeln bei Salzexposition zu untersuchen und die molekularen Mechanismen für diese Anpassung zu identifizieren (ii) Zu analysieren, welche Rolle die verdickten Wurzeln von P. euphratica bei der Salztoleranz spielen (iii) Herauszufinden, welchen Einfluss der Transpirationssog auf die Translokation von Nährstoffen unter salinen Bedingungen hat. Um die Wurzelmorphologie von P. euphratica bei hoher Salinität zu untersuchen, wurden Pflanzen schrittweise erhöhten NaCl Konzentrationen ausgesetzt. Dazu wurde die Salzkonzentration in der Nährlösung der Pflanzen in 24 h Schritten um je 50 mM NaCl erhöht bis die Zielkonzentration von 150 mM NaCl erreicht war. P. euphratica bildet nach etwa 5-6 Tagen bei 150 mM NaCl verdickte Haupt- und Seitenwurzeln. Um die Genese dieser Wurzeln zu untersuchen wurden nach 2 Tagen bei 150 mM (vor der Verdickung) Proben zur Analyse der Wurzelmorpholgie, sowie zur Transkriptom Analyse genommen. Nach 12 Tagen (nach der Verdickung) wurden erneut Proben genommen. Während des Versuchszeitraums wurde auch kontinuierlich der Gaswechsel (Photosynthese Rate, Transpiration Rate), sowie die stomatäre Leitfähigkeit der Pflanzen bestimmt. Mit zunehmender Salzexposition schlossen die Pflanzen vermehrt ihre Stomata, was sich in verringerter stomatärer Leitfähigkeit und daraus resultierend verringerter CO2 Assimilation und Transpiration widerspiegelte. Interessanterweise erholte sie die Photosyntheserate aber nach 11 Tagen bei 150 mM NaCl obwohl die stomatäre Leitfähigkeit auf konstant niedrigem Level blieb. Dies deutet darauf hin, dass die Pflanzen einen Weg gefunden haben, das verbleibende CO2 in den Interzelluarräumen effektiver zu nutzen als zuvor. Die auffälligste Anpassung an Salinität sind die verdickten Wurzeln. Im Vergleich zu den Kontrollpflanzen war die Hauptwurzel salzexponierter Pflanzen doppelt so dick, die Seitenwurzeln 1,5 mal so dick. Die mikroskopische Betrachtung von Längsschnitten der Hauptwurzel zeigte, dass dieser Zuwachs auf eine erhöhte Anzahl an Cortex Zellen zurückzuführen war. Analyse der Trocken- zu Frischgewichtrate ergab keinen Unterschied zwischen den dicken Wurzeln der salzexponierten Pflanzen vergleichen mit den Kontrollen, was darauf schließen lässt, dass die Pflanzen kein zusätzliches Wasser in ihre Zellen eingelagert haben, wie es beispielsweise Halophyten machen. In Blättern hingegen war sogar eine Abnahme des Wassergehalts festzustellen. Lange Salzexposition resultierte in erhöhtem Natrium Gehalt in Hauptwurzeln und Blättern, jedoch nicht in Seitenwurzeln. Der Kalium- und Kalziumgehalt war in beiden Wurzeltypen deutlich reduziert, interessanterweise jedoch nicht in den Blättern. Neben Wildtyp Pflanzen wurden auch Pflanzen, die das Auxin-Reporterkonstrukt GH3:GUS exprimieren, untersucht um festzustellen, ob das Phytohormon Auxin bei der Salzanpassung der Wurzeln eine Rolle spielt. Hier wurden allerdings keine Unterschiede in der Auxinverteilung zwischen salzexponierten und Kontrollwurzeln festgestellt. Analyse der Transkriptionsdaten vor und nach Wurzelverdickung sollten Aufschluss darüber geben welche Gene an diesem morphologischen Akklimatisierungsprozess beteiligt sind. Dabei wurde der Fokus auf folgende Genfamilien gelegt: Pectin Methylesterasen, Expansine, Expansin-like Gene, Cellulose Synthasen, Cellulose Synthase-like Gene, Xyloglucan-Endotransglucosylasen/hydrolasen, Fasciclin-like arabinogalactan Gene, MYB and NAC-Transcriptionsfaktoren. Zum ersten Zeitpunkt wurde eine erhöhte Transkription aller oben genannter Zellwandsythese Gene festgestellt, was sehr wahrscheinlich zu der erhöhten Bildung von Cortex-Zellen führt. Zum 12 Tage Zeitpunkt waren die Transkription der meisten dieser Gene wieder herunterreguliert, was darauf schließen lässt, dass die Anpassung auf transkriptioneller Ebene zu diesem Zeitpunkt abgeschlossen war. Dies deckt sich auch mit der Beobachtung, dass die Wurzeln sich bei längerer Salzexposition nicht kontinuierlich weiter verdicken. Bei den Seitenwurzeln war zu beiden Zeitpunkten erhöhte Transkription der oben genannten Gene zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die Verdickung der Seitenwurzeln langsamer und über einen längeren Zeitraum stattfindet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass P. euphratica auf erhöhte Salzkonzentrationen mit einer Verdickung der Wurzeln reagiert, welche auf vermehrte Bildung von Cortex Zellen zurückzuführen ist. Dadurch ist es der Pflanze möglich das Natrium auf mehr Zellen zu verteilen und so die Toxizität zu senken. Das Signal für die Verdickung ist sehr wahrscheinlich eine erhöhte intrazelluläre Natrium Konzentration, die zu erhöhter Transkription von Zellwandsynthese-Genen führt. Um zu analysieren, wie diese verdickten Wurzeln dazu beitragen, dass P. euphratica höhere Salzkonzentrationen als andere Pappeln tolerieren kann, wurde die Aufnahme und Abgabe von NaCl in dicken und dünnen Wurzeln untersucht. Der Einsatz von radioaktiv markiertem Natrium (22Na+) erlaubte es dabei zwischen neu aufgenommenem und bereits in der Pflanze vorhandenem Natrium zu unterscheiden. Verdickte Wurzeln haben deutlich weniger Natrium aufgenommen im Vergleich zu dünnen Wurzeln, die der gleichen Natriumkonzentration ausgesetzt wurden. Umgekehrt mussten dünne Wurzeln mehr Natrium ausschleusen, als das bei dicken Wurzeln der Fall war. Transkriptomanalysen zeigten, dass die Gene, die für die Kontrolle der intrazellulären Natriumkonzentration verantwortlich sind (Na+/H+ Antiporter: NHX, NhaD und ATPasen), bereits unter Kontrollbedingungen stark exprimiert sind, was darauf schließen lässt, dass die Pflanzen bereits vorangepasst sind an erhöhte Salzkonzentrationen in ihrer Umgebung. Nach kurzer Salzexposition (2 Tage bei 150 mM) werden zusätzlich zwei weitere NHX Gene stärker transkribiert sowie Gene, deren Genprodukte essentielle Aufgaben in der Kalzium-Signalübertragung haben. Hier ist insbesondere der SOS Signalweg zu nennen, welcher essentiell für die Regulation das Natrium Gehalts in der Zelle ist. Nach 12 Tagen Salzexposition ist die Transkription dieser Gene jedoch wieder herunterreguliert, was den Schluss zulässt, dass Kalzium als Signalmolekül besonders in der frühen Anpassung an erhöhte Salzkonzentrationen wichtig ist. Darüber ist auch die Transkription von NADPH Oxidasen, die reaktive Sauerstoffspezies produzieren, die wiederum als Signalmoleküle wirken, über den gesamten Expositionszeitraum hochreguliert. Ein weiterer interessanter Punkt ist, dass dicke Wurzeln dazu in der Lage sind dem Verlust von Kalium Ionen entgegenzuwirken, was auf eine verringerte Expression von Kalium Transportern und nicht-selektiven Kation Kanälen zurückzuführen ist. Es wurde zudem ein erhöhter Phosphor Gehalt in dicken Wurzeln festgestellt. Die Ursache hierfür ist sehr wahrscheinlich eine erhöhte Transkription von Phosphor Transporter Genen im Vergleich zu dünnen Wurzeln. Diese Ergebnisse zeigen, dass P. euphratica bereits unter Kontrollbedingungen an das Auftreten höherer Salzkonzentrationen (bis 150 mM NaCl) angepasst ist. Bei Salzexposition sind dann nur noch kleinere Anpassungen im Transkriptom notwendig um den toxischen Effekt des Natriums abzumildern und eine gesunde Nährstoffbalance zu gewährleisten. Der Transpirationsstrom durch das Xylem ist hauptverantwortlich für die Verteilung von Nährstoffen aus den Wurzeln in alle Bereich der Pflanze. Wie bereits zuvor gezeigt hat NaCl einen Einfluss auf die Verteilung von Nährstoffen in der Pflanze. Um zu analysieren welchen Einfluss einerseits das Salz, andererseits der Transpirationsstrom auf die Verteilung von Nährelementen hat, wurde die salz-sensitive Pappel Art P. x canescens entweder NaCl, ABA oder einer Kombination aus beiden Substanzen ausgesetzt. ABA ist das zentrale Trockenstress Hormon im pflanzlichen Stoffwechsel und bewirkt bei Ausschüttung das Schließen der Stomata und damit eine Verringerung des Transpirationsstroms. Während für K+, Ca2+ und Mg2+ in Wurzeln als auch in Blättern sowohl unter Salz, als auch unter ABA Gabe, geringere Gehalte gemessen wurden verglichen mit dem Kontrollpflanzen, wurde in Blättern unter Salzexposition sogar ein höherer K+ Gehalt gefunden, was unter ABA Gabe nicht der Fall war. Dies zeigt, dass die Translokation von Ca2+ und Mg2+ vornehmlich durch den Transpirationsstrom bewerkstelligt wird, während die Regulation des K+ Gehalt bei Salzexposition in den Blättern weitestgehend unabhängig von diesem ist. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die salz-tolerante Spezies P. euphratica bei Salzexposition verdickte Wurzeln ausbildet, indem mehr Cortex-Zellen gebildet werden. Dadurch wird das Gesamtzell-Lumen in der Wurzel erhöht um die Konzentration an Natrium Ionen in der Zelle zu senken. Dicke Wurzeln nehmen auch weniger Natrium auf als dünne Wurzeln, was ebenfalls zu einer geringen intrazellulären Natriumkonzentration beiträgt. Darüber hinaus kann P. euphratica den Kalium Gehalt in den Blättern aufrechterhalten, obwohl in Wurzeln weniger Kalium detektiert wurde als unter Kontrollbedingungen. Diese Anpassungen sind zurückzuführen auf eine konstant hohe Transkription der beteiligten Gene auch in Abwesenheit von NaCl. So ist die Pflanze dauerhaft auf die Erhöhung der Salzkonzentration an ihrem Standort vorbereitet, was ihr einen Vorteil gegenüber Spezies bringt, die unter Salzexposition erst ihre Anpassungsmechanismen aktivieren müssen.

Salinization of terrestrial land is a global environmental problem, causing loss in soil fertility. Cultivation of salt tolerant species counteracts soil degradation and ensures productive utilization of salt-affected lands. But the tolerance mechanisms of salt-tolerant plants are not entirely understood. Salt tolerance of a plant involves several adaptations at the physiological, morphological and molecular levels. Morphological adaptation via increased tissue thickness and succulence is one of the strategies followed by halophytes (salt tolerant plant) under salinity. Succulent tissues possess larger cell with higher water content. However, little is known about morphological acclimation processes to high salinity in non-halophytic plants such as the salt-tolerant Populus euphratica. Under salinity, the gradual buildup of salt ions in the plant cells causes toxicity and leads the plant to death. In addition, salt ions can greatly affect the uptake and supply of macronutrients like potassium, calcium and magnesium. However, it is not completely known how the root to shoot translocation of macronutrients is affected by sodium under salinity. In addition, it would be interesting to check whether the reduction in translocation processes can reduce salt accumulation in leaves under salinity or not. In this thesis, I studied the acclimation and tolerance mechanisms in a salt-tolerant, P. euphratica and in a salt-susceptible poplar species, Populus x canescens. I addressed the following goals: (i) to characterize root morphology and plant gas exchange under salinity and describe the underlying molecular regulation, (ii) to investigate whether root thickening under salinity contributes to enhanced salt tolerance of P. euphratica, and (iii) to dissect the influence of the transpirational pull and salinity on the distribution of nutrients in the plant. To characterize the root morphology of P. euphratica under high salinity, I adapted the plants to increased salinity by gradually increasing NaCl concentrations from 50 mM to 150 mM and investigated the changes in root morphology after short- (2 days) and long-term (12 days) high salt (150 mM NaCl) exposure. Gas exchange was measured during the salt exposure period in salt-stressed plants and controls (grown without NaCl) to observe responses of plant under salinity. The molecular regulation induced by short- and long-term salt exposure was studied by transcriptome analysis of roots and leaves. To investigate the impact of auxin in root morphology under salinity, transgenic P. euphratica plants transformed with auxin-inducible promoter reporter GH3::GUS construct were used. With increasing NaCl concentration in the medium from 50 mM to 150 mM, gas exchange significantly declined in stressed plants. However, the stressed plants showed an improved CO2 assimilation rate after 11 days of exposure to 150 mM NaCl by consuming sub-stomatal CO2 more efficiently. After long-term salt exposure, main roots showed two-times and lateral roots 1.5 times greater diameters than control roots. Longitudinal sections revealed that an increased number of cortex cells was responsible for the increased thickness of main roots under stress. The dry-to-fresh mass ratio in long-term stressed main and lateral roots did not differ from controls indicating no changes in water content in thick roots compared to control thin roots. In contrast, increased dry-to-fresh mass ratio in leaves after short- and long-term salt exposure suggested that water content decreased in leaves under salinity. Na content increased significantly in main roots and leaves, but not in lateral roots, after long-term salt exposure. Among macronutrients, K and Ca decreased significantly in main and lateral roots under salinity, but nutrient levels were maintained in the leaves. The transgenic plants containing GH3::GUS construct did not show strong noticeable changes in the GUS staining in main and lateral roots after long-term salt exposure. This observation suggested that auxin has no apparent role in the alterations of root morphology under salinity. The salt-induced changes in the regulation of genes for cell wall organization and biogenesis were studied by transcriptome analyses. Pectin methylesterase, expansin, expansin-like, cellulose synthase, cellulose synthase-like, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, fasciclin-like arabinogalactan, MYB and NAC-type transcription factors were the most abundant differentially expressed gene families. The salt-induced regulation of cell wall associated genes was less affected in leaves than in roots suggesting no stimulation for alteration in leaf morphology. The upregulation of genes involved in the synthesis of cell wall polysaccharides and cell wall extension in the main roots after short-term salt exposure indicated that the reactions to modify cell wall were activated. However, most of these genes were downregulated in thick main roots after long-term salt exposure. The increase in lateral root thickness was likely a result of up- and down-regulation of these cell wall associated genes at both times. Therefore, this study shows that P. euphratica adjusted root morphology by increasing root diameter under high salinity. Increased root thickness in response to salinity was likely induced by salt accumulation in the tissue and regulated by cell wall modifying genes to manage ion toxicity through increased volume for salt deposition. To investigate the second goal, I studied the contribution of physiological root plasticity of P. euphratica to cope with saline conditions and explored the underlying transcriptional regulation. To distinguish between Na+ present in roots and newly taken up Na+, 22Na+ was used as a tracer. Both Na+ uptake from and extrusion into the external solution was strongly reduced in salt-acclimated thick roots compared with non-acclimated thin roots. Transcriptome analyses showed high expression of genes required for the control of Na+ levels (Na+/H+ antiporters: SOS1, NHX, NhaD and ATPases) in both salt-acclimated and non-acclimated roots. Significant increases in transcript abundances were found initially (after 2 days of 150 mM NaCl application) for two NHX family members and many genes with potential functions in Ca2+ signaling. But these responses disappeared in thick, salt-acclimated roots and the majority of differentially expressed genes related to Ca2+ signaling were downregulated. Transcriptional upregulation was observed for stress signaling via NADPH oxidases, irrespective of short- or long-term salt exposure. Thick roots showed higher K+ retention under salt stress than thin roots, presumably as the result of transcriptional downregulation of K+ transporters and non-selective cation channels. Thick roots contained elevated P concentrations, which corresponded to enhanced transcript levels of P transporters. In conclusion, acclimated thick roots have a high ability to control Na+ levels without additional transcriptional activation of the SOS pathway. They are relatively resistant toward changes in salt levels and maintain a favorable nutrient balance. Water flow through the xylem is driven by transpiration and this is thought to be the major driving force for the translocation process. To investigate the third goal, I used the salt-sensitive hybrid poplar, Populus × canescens. The phytohormone Abscisic acid (ABA) is known to regulate stomatal openings and consequently affects the transpiration rate. To differentiate between the effects of transpiration pull from those of salt, we compared salt-stressed, ABA treated, and combined salt- and ABA treated poplars (P. × canescens) with untreated controls. The root content of macronutrients like K+, Ca2+ and Mg2+ was reduced in response to salinity. Decreased Ca2+ levels in roots corresponded to decreased Ca2+ levels in leaves. The same was observed for Mg2+ levels in roots and leaves. In contrast, K+ levels in leaves increased under salt stress, although root K+ levels were reduced. However, reduced transpiration in response to salinity did not decrease Na+ accumulation in the leaves. During ABA treatment, leaf Ca2+ and leaf Mg2+ levels decreased comparably to the salt treatment, while leaf K+ level was unaffected, although stomatal conductance was reduced by salt or ABA treatment. Thus, these results suggest that Ca2+ and Mg2+ levels in leaves were predominantly affected by the transpirational pull, while loading and retention of K+ in leaves are enhanced in response to salt stress, but independently of the transpirational pull. In summary, the salt-tolerant poplar P. euphratica employs a morphological adaptation mechanism in response to high salinity by developing root thickening. Increased root thickness in P. euphratica is induced by salt. An increase in the number of cortex cells which leads to enlarged diameter of first order main roots in response to high salinity is likely a strategy to control ion toxicity via increasing the volume for salt deposition. Moreover, salt-induced thick roots contribute to the outstanding salt tolerance of P. euphratica by controlling Na+ influx from and efflux into the outside environment as well as enhancing K+ retention ability in response to high salinity. Besides, this species is able to maintain the levels of macronutrients K+, Ca2+ and Mg2+ in the leaves, even though root contents of K+ and Ca2+ is negatively affected due to salinity. The salt-induced thick roots might be an evolutionary adaptation of P. euphratica to salinity, which is associated with constant activation rather than over-expression of stress regulatory pathways. Thus, P. euphratica has an improved strategy to maintain a favourable nutrient balance, to control ion toxicity and to continue gas exchange efficiently under high salinity.

2023-02-17