Laserinduzierte Fluoreszenz-Diagnostik zur Detektion entzündlicher Gelenkveränderungen | Etablierung einer neuen Methode am Mausmodell | Detection of inflammatory joint processes based on laser-induced fluorescence | Implementation of a new method using a mouse model

Titelblatt Inhaltsverzeichnis 1\. Verwendete Abkürzungen 2\. Einleitung 3\. Grundlagen und Literaturübersicht 4\. Material und Methoden 5\. Ergebnisse 6\. Diskussion 7\. Zusammenfassung 8\. Summary 9\. Literaturverzeichnis 10\. Tabellen 11\. Danksagung 12\. Lebenslauf Selbständigkeitserklärung

Ziel dieser Arbeit war der Nachweis entzündlicher Gelenkveränderungen am Modell der Maus mit Hilfe unspezifischer Nahinfrarot (NIR)�Farbstoffe. Als Tiermodell wurde das etablierte Modell der Lyme-Borreliose der Maus eingesetzt. Es wurde die normierte Fluoreszenz im Bereich der Sprunggelenke nach der intravenösen Gabe von NIR-Farbstoffen dargestellt und ermittelt. In Vorversuchen wurden die zwei unspezifischen NIR-Farbstoffe Indocyaningrün (ICG) und NIR-1 auf ihre Eignung zum Nachweis einer Arthritis überprüft und die Optimierung des Messablaufs und der Messtechnik vorgenommen. Während sich mit ICG aufgrund der hohen Plasmaproteinbindung lediglich die Anflutungsphase im Körper bzw. die erhöhte Perfusion im Entzündungsgebiet darstellen lassen kann, kommt es bei dem hydrophilen Farbstoff NIR-1 zu einer Extravasation und Anreicherung im Bereich der entzündlichen Veränderungen. In weiterführenden Versuchen wurde daher der Farbstoff NIR-1 sieben Kontroll- und zehn Tieren mit einer Gelenkentzündung in der Dosis 1 µmol/kg sowie acht Kontroll- und zehn Tieren mit Arthritis in der Dosis 2 µmol/kg injiziert. Die Anregung der Laser- induzierten Fluoreszenz erfolgte mit einem Festkörperlasersystem bei einer Anregungswellenlänge von ? = 740 nm. Nach der Applikation des Farbstoffes wurde die entstehende Fluoreszenz mittels intensitvierter CCD-Kamera über einen Zeitraum von ca. fünf Minuten erfasst. Für die Dosis 1 µmol/kg konnten signifikante Unterschiede zwischen Kontrolltieren und Tieren mit einer Gelenkentzündung für den Kurvenverlauf (Steigung) und für die normierte Fluoreszenzintensität drei und fünf Minuten nach Farbstoffinjektion ermittelt werden, wobei sich die mittelgradigen Arthritiden im Vergleich zu den geringgradigen und hochgradigen Arthritiden signalreicher darstellten. Für die Dosis 2 µmol/kg unterschieden sich diese Werte zwischen den Tiergruppen nicht. Eine individuelle Auswertung der NIR-Bilder durch zwei Untersucher anhand der Verteilungsmuster der Fluoreszenzintensität ermöglichte mit der Dosis 2 µmol/kg eine erste Aussage über das Vorliegen einer Arthritis bei Mäusen mit einer Borrelien-Infektion. Bei einer Dosis von 1 µmol/kg ergab die individuelle Auswertung kein eindeutiges Ergebnis. Die histologische Untersuchung anhand HE-gefärbter Schnittpräparate zeigte bei den Tieren mit einer Borrelien-Infektion pathologische Veränderungen im Bereich der Synovialis, der Achillessehne, im umliegenden Gewebe und vereinzelt auch an Knorpel und Knochen. Das Ergebnis zeigt, dass die farbstoffunterstützte NIR- Bildgebung das Potential besitzt, als Früherkennungsverfahren entzündlicher Veränderungen in der Human- und Veterinärmedizin z. B. in der Diagnose von rheumatoider Arthritis eingesetzt zu werden. Sie stellt ein einfach zu bedienendes, relativ kostengünstiges Verfahren dar, welches mit geringen Anforderungen an den apparativen, finanziellen sowie personellen Aufwand und ohne ionisierende Strahlung auskommt.

The aim of the present study was to investigate the detection of inflammatory joint processes using unspecific near-infrared (NIR) dyes. The experiments were conducted in an established murine model of Lyme arthritis. Fluorescence imaging of the ankle joints was performed after intravenous administration of NIR dyes. PreIiminary experiments were performed to test the potential of two unspecific NIR dyes, indocyanine green (ICG) and NIR-1, to detection arthritis and to optimize the imaging procedure and technique. While ICG with its pronounced plasma protein binding only enables visualization of contrast medium arrival in the body and of higher perfusion in inflamed areas, the hydrophilic NIR-1 dye shows extravasation and accumulation in areas of inflammation. The NIR-1 dye was therefore used in the further experiments where it was tested at a dose of 1 µmol/kg in seven control animals and ten arthritic animals and at a dose of 2 µmol/kg in eight control animals and ten arthritic animals. Laser-induced fluorescence was excited with a solid-state laser system at an excitation wavelength of ? = 740 nm. Fluorescence was recorded using an intensified CCD camera. A series of 60 images was acquired over a period of about three minutes starting immediately with the administration of the dye. A final fluorescence image was obtained five minutes after dye injection. Quantitative analysis demonstrated significant differences between control animals and arthritic mice in the fluorescence intensity curves (steepness) and the normalized fluorescence intensities three and five minutes after dye injection at a dose of 1 µmol/kg. A higher signal intensity was found in animals with a moderate arthritis compared to those with mild or severe signs of inflammation. No such differences were seen between arthritic mice and control animals after dye injection at a dose of 2 µmol/kg. Qualitative analysis of the NIR images by two investigators evaluating the distribution of fluorescence intensity revealed preliminary information on the presence of arthritis in Borrelia-infected mice after administration of 2 µmol/kg. For the lower dose of 1 µmol/kg the results of the qualitative analysis were inconclusive. The histological examination of H&E-stained; paraffinsections demonstrated pathological changes of the synovial area, Achilles� tendon, surrounding tissue, and occasionally also of the cartilage and bone in the mice with Lyme arthritis. The results suggest that dye-enhanced NIR imaging may be used as a diagnostic tool in early identification of inflammatory changes, for instance in the diagnosis of rheumatoid arthritis. It is an easy to use and fairly inexpensive modality that requires affordable equipment and does not involve exposure to ionizing radiation.