Kultivierung embryonaler Stammzellen der Maus unter serumreduzierten Kulturbedingungen mit und ohne Supplementierung eines Serumersatzes | Cultivation of mouse embryonic stem cells under serum-reduced culture conditions with and without a supplementation serum replacement

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus haben die Fähigkeit sich in Zellkultur nahezu unbegrenzt zu vermehren und sich unter geeigneten Kultivierungsbedingungen in die Zelltypen aller drei Keimblätter Mesoderm, Endoderm und Ektoderm zu entwickeln. Für die erfolgreiche in-vitro- Kultivierung von ES-Zellen ist es wichtig, die Umgebungsbedingungen der Zellen so weit wie möglich den in-vivo-Bedingungen dieses Zelltyps anzupassen. Dies gilt insbesondere für die Versorgung der Zellen mit einem geeigneten Medium und den entsprechenden Zusätzen. Als ein solcher Zusatz wird fötales Kälberserum (FBS) eingesetzt, das aus einer Vielzahl unterschiedlicher Komponenten besteht, die für das Wachstum und die Differenzierung der ES- Zellen essentiell sind. Da es sich hierbei um ein undefiniertes Naturprodukt mit hoher Chargenvariabilität handelt, dessen Gewinnung ethisch bedenklich ist, wird versucht ES-Zellen ohne den Zusatz von FBS zu kultivieren. Bisher ist es kaum gelungen, undifferenzierte embryonale Stammzellen der Maus effizient unter serumfreien Kulturbedingungen in schlagende Kardiomyozyten zu differenzieren. In der vorliegenden Arb eit wurde die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus unter serumreduzierten Kulturbedingungen charakterisiert und ein zuvor etabliertes Gemisch von Supplementen auf seine Eignung als Serumersatz beurteilt. Dazu wurden zunä chst Endpunkte für die Untersuchung der in-vitro-Differenzierung von ES-Zellen zu Kardiomyozyten etabliert und auf die Praktikabilität und Redundanz ihres Informationsgehaltes überprüft. Dafür wurden die embryonalen Stammzellen über einen Zeitraum von zehn Tagen unter Standardkulturbedingungen (15 % FBS) kultiviert und an den Differenzierungstagen 5 bis 10 mit verschiedenen Methoden auf ihren Differenzierungsstatus untersucht. Neben der morphologischen Beurteilung der Zellen auf spontane Kontraktionen wurde die Differenzierung durch Markierung filamentärer Strukturen visualisiert und mittels Durchflusszytometrie und Genexpressionsanlyse quantifiziert. Als herzmuskelzellspezifisches Target diente hierzu Myosin heavy chain (MHC), welches sowohl mit der Immunzytochemie und in der FACS-Analyse auf Proteinebene, als auch in der Real Time PCR auf RNA Ebene nachzuweisen war. Im Gegensatz zur herkömmlichen mikroskopischen Auswertung bieten diese Methoden die Möglichkeit die ES-Zelldifferenzierung zu Kardiomyozyten zu einem früheren Zeitunkt zu erfassen, jedoch ließen sich objektive sowie reproduzierbare Ergebnisse nur mit der RT-PCR erreichen. Die Durchführung von an das Protokoll des Embryonalen Stammzelltest (EST) anlehnenden Proliferations-und Differenzierungstests, sowie die Anwendung der zuvor etablierten Messmethoden ermöglichte im zweiten Abschnitt die Untersuchung des Einflusses von serumreduzierten Kulturbedingungen mit und ohne Supplementierung eines Serumersatzes auf das Wachstums- und Differenzierungspotential der Stammzellen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der serumreduzierten Kultivierung ohne Supplementierung mit einem Serumersatz mit abnehmender Serumkonzentration ein Rückgang der Differenzierung zu verzeichnen war. Diese Zellpopulationen zeigten Unterschiede in der Immunzytochemie, wiesen eine verminderte Kontraktilität sowie eine geringere Expression von MHC auf Protein- und RNA-Ebene auf. Darüber hinaus konnte jedoch bei einer Serumkonzentration von 2,5 % FBS mittels FACS-Analyse und Real Time PCR eine leichte Zunahme des Differenzierungsverhaltens der ES- Zellen beobachtet werden. Die Supplementierung mit einem als Serumersatz geltenden Gemisch aus Wachstumsfaktoren, Hormonen, Proteinen, Vitaminen, Spurenelementen und Antioxidantien ermöglichte die Kultivierung und Differenzierung von ES-Zellen zu Kardiomyozyten. Im Vergleich zum Standardkulturmedium (15 % FBS) zeigte sich mit 2 Tagen Verzögerung in der 24-Loch Funktionsanalyse eine maximale Kontraktilität. Immunzytologisch und durchflusszytometrisch konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Differenzierung beobachtet werden. Eine Induktion kardialer α-MHC RNA wurde hingegen bei einem Restserumanteil von 0,5 % FBS detektiert. Relativiert zum Standardkulturmedium zeigte sich in diesen Testansätzen eine bis zu 7-fach höhere Expression. Schwächen hinsichtlich der Adhäsion und daraus resultierende Zellverluste spiegelten sich in den niedrigen Werten des Proliferationsverhaltens wieder. In dieser Studie erwies sich das Gemisch von Supplementen als geeignete Alternative zur Verwendung von fötalem Kälberserum für die Kultivierung von murinen embryonalen Stammzellen. Die Supplementierung definierter Bestandteile lässt embryonale Stammzellen unter nahezu serumfreien Kulturbedingungen zu Kardiomyozyten differenzieren. Eine daraus resultierende Serumreduktion von 15 % FBS auf lediglich 0,5 % FBS im Zellkulturmedium führt somit zu einer höheren Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit in Testsystemen. Zu dem leistet dies einen wichtigen Beitrag zu einer besseren Vereinbarkeit von Ethik und Wissenschaft.

Murine embryonic stem cells (ES-cells) in cell culture are capable of unlimited self-renewal. Provided with ideal culture conditions they develop into meso-, endo- and ectodermal cell types. Therefore the culture conditions should mimic the in-vivo environment of the specific cell type. This requires an appropriate cell culture medium and adequate supplements. A commonly used supplement is fetal bovine serum (FBS) which contains many different ingredients that are essential for proliferation and differentiation. FBS is an undefined natural product with high batch to batch variability. Great ethical doubts exist concerning the method by which it is obtained. Therefore it has been tried to keep ES-cells without the addition of FBS. Experiments investigating differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes under serum free culture conditions in the absence of FBS have shown little success. The differentiation of ES-cells under serum reduced culture conditions, as well as the usage of an approved mixture of supplements as a serum replacement, has been tested in the present study. Methods for the evaluation of ES-cell derived cardiomyocytes have been established and their practicalities and redundancy have been valued. The ES-cells were cultured for 10 days in standard culture conditions (15 % FBS) and their differentiation status was reported on days 5 to 10 using various test methods. Aside from the morphological evaluation of spontaneous contraction, differentiation was visualised by immunocytological staining of filaments and quantified by using flow cytometry and Real Time PCR analysis. Myosin heavy chain (MHC) served as the cardiomyocyte specific target. The presence of its proteins was shown with immunocytochemical staining and FACS-analysis and the presence of its RNA with Real Time PCR. Unlike conventional light microscope examination these methods allow the detection of earlier stages of ES-cell differentiation into cardiomyocytes. Consistant and objective results, however, have only been achieved with PCR. The procedure of proliferation and differentiation assays based on the EST-protocol as well as the utilisation of the previously established measuring methods, has enabled the examination of the influence of serum reduced culture conditions with or without serum replacement on the proliferation and differentiation in the 2nd part of the study. In the serum reduced culturing without any supply of serum replacement, a decreased differentiation with lower serum concentration could be noticed. Immunocytochemically the cell population showed differences as well as reduced contraction and lower expression of MHC. However a slight increase of differentiation was found at serum concentrations of 2,5 % FBS. Supplementing a serum replacement containining growth factors, hormones, proteins, vitamins, trace elements and antioxidants allowed the culturing of ES-cells and enabled their differentiation into cardiomyocytes. Although the maximum of contraction was delayed for 2 days, no differences could be detected in the differentiation, compared to the standard culture medium (15 % FBS) using immuncytochemistry and flow cytometry. An induction of cardiac α-MHC RNA was seen at a serum concentration of 0,5 %. These sample preparations showed a 7 times increased expression in comparison to the standard culture medium. Low proliferation rates reflect the degraded adhesion and resulting cell loss. In this study the supplement mixture for culturing ES-cells proved to be an adequate alternative to FBS. The addition of defined selected additives enables the differentiation of ES-cells into ca rdiomyocytes in nearly serum free culture conditions. The serum reduction from 15 % FBS to only 0,5 % FBS leads to higher standardisation and reproducibility of the testing systems. Furthermore it leads to a better compatibility of ethics and scientific research.