The role of a cholesterol consensus motif in HA and of an amphipathic helix in M2 for replication of influenza A virus | Der Effekt des Cholesterin-Konsensus-Motivs in HA und der amphipathischen Helix in M2 auf die Replikation des Influenza-A-Virus

Influenza A virus are enveloped viruses with a spherical or filamentous morphology. In their membrane are two glycoproteins, the hemagglutinin and the neuraminidase as well as the unglycosylated proton channel M2. Virus entry into host cells depends on the fusion activity of HA and the proton conductance activity of M2, whereas virus assembly and budding is supposed to be initiated by accumulation of HA in cholesterol- and sphingolipid-enriched nanodomains at the plasma membrane. Furthermore, the amphipathic helix in the cytoplasmic tail of M2 is engaged in virus budding and membrane scission to release progeny virions from the host membrane. In this study the effect of mutations in a conserved cholesterol consensus motif (CCM) of HA on virus assembly and HA’s fusion activity was investigated. Phylogenetic group 2 HAs contain the conserved CCM motif Y-K-L-W in the transmembrane region. Studies previously done in our group reported that mutations in the CCM retarded intracellular transport of HA and reduced its association with cholesterol-rich nanodomains. Here I firstly analyzed whether cholesterol interacts with the CCM. The click-labeling with photocholesterol was significantly reduced when the whole CCM was substituted by alanine, both using immunoprecipitated HA and when HA was embedded in cellular membranes. In the content of virus replication, no virus was rescued if the whole motif is replaced (mutant YKLW4A); single (LA) or double (YK2A and LW2A) mutated virus exhibited reduced titers and a comparative fitness disadvantage. The apical transport of HA and apical budding of viruses in polarized cells were not disturbed by these mutations. However, reduced amounts of HA and cholesterol were incorporated into the viral membrane. Mutant viruses showed decreased fusion activity as demonstrated by hemolysis and fluorescence dequenching assays. Cell-cell fusion assay using dual-labelled erythrocytes and HA-expressing cells revealed that HA-YKLW4A can fuse with erythrocytes, but the number of events was reduced. Even after acidification unfused erythrocytes remained cell-bound, a phenomenon not observed in HA-WT expressing cells. Thus, cholesterol binding to HA has effects on membrane fusion, mainly on lipid mixing and possibly a preceding step. Being also crucial in virus assembly and budding, the amphipathic helix in the cytoplasmic tail of M2 was also investigated. Since a variety of amphipathic peptides mediate membrane deformation and induce their vesicularisation, I used reverse genetics to investigate whether they can substitute for M2’s helix. No virus could be generated if M2’s helix was deleted or exchanged to a peptide predicted not to form an amphipathic helix. In contrast, viruses could be rescued if the M2 helix was replaced by helices known to induce membrane curvature, but they showed only slightly decreased virus titers. Transmission EM of infected cells did not exhibit undetached mutant virions with a “bead-on-a-string” morphology, a hallmark of viruses with failed membrane scission. Nevertheless, individual mutant viruses exhibit other defects in M2, such as reduced surface expression and decreased incorporation into virions. The protein composition and specific infectivity was altered as well for most mutant virus particles. I conclude that the presence of an amphipathic helix in M2 is essential for virus replication, but it can be replaced by other curvature-inducing helices from cellular proteins.

Influenza A Viren sind umhüllte Viren mit einer sphärischen oder filamentösen Morphologie. In ihrer Membran befinden sich zwei Glykoproteine, das Hämagglutinin (HA) und die Neuraminidase (NA) sowie der nicht glykosylierte Protonenkanal M2. Der Viruseintritt in Wirtszellen hängt von der Fusionsaktivität von HA und der Protonenleitfähigkeit von M2 ab, wohingegen die Virusassemblierung und -knospung durch Akkumulation von HA in mit Cholesterin und Sphingolipiden angereicherten Nanodomänen an der Plasmamembran ausgelöst wird. Darüber hinaus ist eine amphipathische Helix in der zytoplasmatischen Domäne von M2 an der Virusknospung beteiligt. In dieser Studie wurde die Auswirkung von Mutationen in einem konservierten Cholesterinkonsensusmotiv (CCM) von HA auf die Virusassemblierung und die HA-Fusionsaktivität untersucht. HAs der phylogenetische Gruppe 2 enthalten das konservierte CCM Y-K-L-W in der Transmembranregion. Zuvor in unserer Gruppe durchgeführte Arbeiten zeigten, dass Mutationen in der CCM den intrazellulären Transport von HA verzögerten und dessen Assoziation mit cholesterinreichen Nanodomänen verringerten. Hier analysierte ich zunächst, ob Cholesterin mit dem CCM interagiert. Die Markierung von HA mit photoaktivierbarem Cholesterin war signifikant verringert, wenn die gesamte CCM durch Alanin ersetzt wurde, sowohl wenn immunpräzipitiertes HA als auch HA eingebettet in der zellulären Membran markiert wurde. Es konnten keine rekombinanten Viren generiert werden, wenn das gesamte CCM-Motiv ersetzt wurde (Mutante YKLW4A). Viren mit einem (LA) oder zwei Austauschen (YK2A und LW2A) in der CCM zeigten reduzierte Titer und einen Fitnessnachteil. Der apikale Transport von HA und das apikale Knospen von Viren in polarisierten Zellen wurden durch diese Mutationen nicht gestört. Reduzierte Mengen an HA und Cholesterin wurden jedoch in die Virusmembran eingebaut. Viren mit mutiertem HA zeigten eine verminderte Fusionsaktivität, wie durch Hämolyse- und Fluoreszenztests gezeigt wurde. Zell-Zell-Fusions-Assays unter Verwendung von doppelt markierten Erythrozyten und HA-exprimierenden Zellen zeigten, dass HA-YKLW4A mit Erythrozyten fusionieren kann, aber die Anzahl der Ereignisse war verringert. Auch nach der Ansäuerung blieben einige fusionierte Erythrozyten zellgebunden, ein Phänomen, das in HA-WT-exprimierenden Zellen nicht beobachtet wurde. Somit hat die Cholesterinbindung an HA Auswirkungen auf die Membranfusion, hauptsächlich auf den Schritt der Hemifusion und möglicherweise auf einen vorhergehenden Schritt. Die amphipathische Helix in der zytoplasmatischen Domäne von M2 ist von entscheidender Bedeutung für die Virusassemblierung und -knospung. Da eine Vielzahl von amphipathischen Peptiden eine Membrankrümmung induzieren kann, habe ich untersucht, ob diese die M2-Helix ersetzen können. Es konnte kein Virus erzeugt werden, wenn die Helix von M2 deletiert wurde oder gegen ein Peptid ausgetauscht wurde, dass keine amphipathische Helix ausbilden kann. Im Gegensatz dazu konnten Viren hergestellt werden, wenn die M2-Helix durch Helices ersetzt wurden, von denen bekannt ist, dass sie eine Membrankrümmung induzieren. Diese Viren zeigten auch nur geringfügig verringerte Titer. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten infizierter Zellen zeigten keine nicht abgelösten mutierten Virionen mit einer "Bead-on-a-String" Morphologie, ein Kennzeichen für Viren mit fehlgeschlagener Membranspaltung. Die mutierten Viren zeigten andere Defekte in M2, wie eine reduzierte Oberflächenexpression und einen verringerten Einbau in Viruspartikel. Die Proteinzusammensetzung und die spezifische Infektiosität waren auch für die meisten mutierten Viruspartikel geändert. Ich schließe daraus, dass das Vorhandensein einer amphipathischen Helix in M2 für die Virusreplikation wesentlich ist, aber durch andere krümmungsinduzierende Helices aus zellulären Proteinen ersetzt werden kann.