Análisis del proteoma y volatiloma de nuevas cepas de levadura silvestres con mejor aptitud enológica para afrontar la adaptación de la enología al cambio climático | Proteome and volatilome analysis of new wild yeast strains with good oenological aptitude to face the adaptation of oenology to climate change

A nivel global, la gran mayoría de sectores científicos coinciden en afirmar la existencia del cambio climático hoy en día; un cambio climático cuyo impacto en la viticultura conllevará notables efectos en la calidad de la uva y sus vinos. Como consecuencia, se producirá un desajuste entre la madurez tecnológica y fenólica, algo que provocará que los mostos y vinos lleguen a presentar con más frecuencia características cualitativas no deseables. Dichas características pueden ir desde un contenido elevado de azúcar en la uva y, consecuentemente, un elevado grado alcohólico de los vinos; hasta una disminución de la acidez, fundamentalmente del ácido málico, resultando de tales efectos vinos planos y frágiles. Desde el punto de vista de la microbiología enológica, las variaciones asociadas al cambio climático previstas en las condiciones ambientales (temperatura, estrés hídrico, etc.) en la composición del sustrato, o incluso en la fisiología de la uva y en las técnicas de cultivo, incrementan la probabilidad de que se modifiquen la ecología, la biodiversidad y el metabolismo de los microorganismos presentes en la viña, la uva, el mosto y el vino. Esta Tesis Doctoral tiene como objetivo realizar un estudio proteómico de cepas de levaduras silvestres con mejor aptitud enológica que puedan aportar nuevas características necesarias para la adaptación de la enología al cambio climático. Asimismo, se pretende la búsqueda de potenciales parámetros indicadores basados en el estudio de los exo-metabolitos de dichas levaduras relacionados con el volatiloma y con las características organolépticas del vino. Se han aislado y seleccionado, por su potencial enológico en condiciones similares a las propiciadas por el cambio climático, diversas cepas silvestres del género de levadura Saccharomyces. Junto a ellas, se ha escogido una cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae con conocida resistencia a dichas condiciones. Con estas levaduras se han llevado a cabo microvinificaciones en mosto blanco para evaluar, tanto en el proceso como en sus resultados, la influencia de factores de estrés como una alta temperatura de fermentación, una adición moderada de anhidrido sulfuroso y un elevado nivel de azúcar en el mosto de partida. De igual modo, se determinó analizar la expresión proteica de las levaduras en diversos puntos de la fermentación, contemplando con mayor interés las proteínas asociadas a procesos biológicos de respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Para llevar a cabo los análisis metabolómicos y proteómicos necesarios para el estudio se emplearon diversas herramientas ómicas de detección y cuantificación precisa, como la cromatografía de gases (GC), asociada a detector FID o combinada con la espectrometría de masas (SM); o la cromatografía de líquidos (LC) asociada con espectrometría de masas. Los resultados revelaron que todas las cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae evaluadas obtuvieron vinos con niveles adecuados de los parámetros enológicos más importantes, los cuales mostraron dependencia de la cepa utilizada. Algunos parámetros, como la acidez volátil, la acidez titulable y el nitrógeno fácilmente asimilable, reflejaron la influencia de la alta temperatura de fermentación con un incremento de sus niveles. El elevado contenido de azúcar inicial en el mosto influyó aumentando el grado alcohólico de los vinos, así como los valores de acidez volátil y de azúcares residuales. La presencia de SO2, sin embargo, no influyó en ninguno de estos parámetros. Con respecto a las cepas de levaduras, se observaron desfases en el inicio de la fermentación de algunas cepas silvestres, B6 y B29, debidos al SO2, sin que ello impidiese que estas cepas pudieran culminar el proceso fermentativo. La levadura comercial, LC, no mostró influencia de la temperatura o la adición de SO2, pero los altos niveles de azúcar residual y el menor grado alcohólico observado en sus vinos en comparación con los de otras cepas fueron indicativo de fermentaciones incompletas. Por otra parte, la composición volátil de los vinos mostró grandes diferencias debidas a las cepas de levaduras, viéndose afectados más del 90% de los compuestos determinados. La temperatura de fermentación influyó en las concentraciones del 75% de ellos, mientras que la concentración alta de azúcar inicial y la adición de SO2, solo afectaron a un 30% de los compuestos. Aun así, la presencia de SO2 resultó significativa en los niveles de varios compuestos mayoritarios (> 10 mg/L en vino), conllevando incrementos en los niveles de alcoholes superiores, polioles y compuestos carbonílicos. En cuanto al perfil aromático de los vinos, los compuestos que presentaron mayores valores de actividad odorante fueron el acetato de isoamilo y el octanoato de etilo, ésteres con descriptores aromáticos frutales, con valores 60 y 43 veces superiores a la unidad. Otros compuestos, como la β-damascenona o la β-ionona, descritos como aportadores de esencias florales y herbáceas, mostraron, respectivamente, valores de actividad odorante 38 y 21 veces superiores a su umbral de percepción. Todo ello propició que los vinos obtenidos se caracterizasen por un mayor contenido en compuestos relacionados con descriptores odorantes florales y frutales, y fueron las cepas LC, B29 y B6 las que presentaron mayores cantidades de dichos compuestos. Al realizar análisis de conglomerados y de componentes principales, se puso de manifiesto que los vinos obtenidos con las cepas B29 y LC fueron diferentes al resto, siendo las series aromáticas floral y la herbácea las responsables de dicha diferenciación. En el caso de la cepa B6 fue la serie frutal la que diferenció a los vinos producidos por esta, en comparación con los obtenidos por el resto de las cepas. Con todo ello, se comprobó la eficiencia fermentativa de ambas cepas de levadura en cuanto a la obtención de vinos con diferentes perfiles aromáticos, algo que, a nivel industrial, concede múltiples alternativas al enólogo para elaborar vinos con características organolépticas específicas. El análisis del proteoma de las cepas de levaduras B6 y LC reveló que un 80.7% de las proteínas expresadas resultaron comunes a ambas levaduras, tanto en presencia como ausencia de SO2. La levadura LC presentó, sin mostrar influencia del SO2, la mayor intensidad de expresión de proteínas de respuesta a estrés osmótico y oxidativo a la mitad del proceso fermentativo (7% de etanol (v/v)), relacionándose este hecho con su incapacidad para terminar la fermentación en altas concentraciones de azúcar. Por otro lado, la cepa B6, mostró mayores intensidades en el inicio y a las 48 horas del proceso, observándose influencia del SO2. Este hecho se corresponde con el retardo que esta cepa presentó para comenzar la fermentación, aunque posteriormente pudiera adaptarse. La investigación realizada en este trabajo ha permitido asentar un punto de anclaje a la obtención de un pool de levaduras silvestres con las mejores aptitudes enológicas para ponerlo a disposición de la industria vitivinícola en un escenario de cambio climático. Estos hallazgos pueden contribuir a la detección, selección y empleo de levaduras silvestres que fermenten con solvencia en condiciones de estrés. Con ello, se presenta un método reproducible y sostenible para combatir los efectos climatológicos adversos a los que el sector vitivinícola se enfrenta a medio y corto plazo, sin perder, para ello, la identidad que caracteriza a sus productos.

Nowadays, most scientific sectors agree in affirming the existence of climate change, whose impact on viticulture will have notable effects on the quality of the grapes and wines. Consequently, there will be a mismatch between technological and phenolic maturity, which is likely to cause undesirable qualitative characteristics in musts and wines. These characteristics can range from a high sugar content in the grapes and, consequently, a high alcoholic level in the wines; to a decrease in acidity, mainly affecting malic acid levels, resulting in flat and fragile wines. Regarding an oenological microbiology viewpoint, the variations associated with climate change expected in the environmental conditions (higher temperature, water stress, etc.) in the composition of the substrate, or even in the physiology of the grape and in cultivation techniques, increase the probability that the ecology, biodiversity, and metabolism of the microorganisms present in the vineyard, grapes, must and wine will be modified. This Doctoral Thesis aims to carry out a proteomic study of wild yeast strains with good oenological aptitude that can provide new characteristics necessary for the adaptation of oenology to climate change. Likewise, the search for potential indicator parameters based on the study of the exo-metabolites of these yeasts related to the volatilome and the organoleptic characteristics of the wine is intended. Several wild strains of the Saccharomyces yeast genus have been isolated and selected due to their oenological potential under conditions similar to those caused by climate change. Along with them, a commercial strain of Saccharomyces cerevisiae with known resistance to these conditions has been chosen. Some microvinifications have been carried out in white must with these yeasts to evaluate, both in the process and in its results, the influence of stress factors such as a high fermentation temperature, a moderate addition of sulfur dioxide and a high level of sugar in the must. Furthermore, it was determined to analyze the protein expression of the yeasts at various chekpoints during the fermentation, focusing on the proteins associated with biological processes in response to osmotic and oxidative stress. To develop the metabolomic and proteomic analyzes necessary for the study, some omics tools for detection and precise quantification were used, such as gas chromatography (GC), associated with a FID detector or combined with mass spectrometry (SM); or liquid chromatography (LC) associated with mass spectrometry. The results revealed that all Saccharomyces cerevisiae yeast strains evaluated obtained wines with adequate levels of the most important oenological parameters, which showed dependence on the strain used. Some parameters, such as volatile acidity, titratable acidity and yeast assimilable nitrogen, reflected the influence of the high fermentation temperature with an increase in their levels. The high initial sugar content in the must leaded to an increase in the alcoholic degree of the wines, as well as in the values of volatile acidity and residual sugars. The presence of SO2, however, did not influence any of these parameters. Regarding the yeasts, delays due to SO2 were observed in the beginning of fermentation of some wild strains, B6 and B29, without this preventing these strains from completing the fermentation. The commercial yeast, LC, showed no influence of temperature or the addition of SO2, but the high levels of residual sugar and the lower alcoholic degree observed in its wines compared to those of other strains were indicative of incomplete fermentations. On the other hand, the volatile composition of the wines showed great differences due to the yeast strains, with more than 90% of the determined compounds being affected. The fermentation temperature influenced the concentrations of 75% of them, while the high initial sugar concentration and the addition of SO2 only affected 30% of the compounds. Nevertheless, the presence of SO2 was significant in the levels of several major compounds (> 10 mg/L in wine), leading to increases in the levels of higher alcohols, polyols and carbonyl compounds. Regarding the aromatic profile of the wines, the compounds that presented the highest values of odorant activity were isoamyl acetate and ethyl octanoate, which are esters with fruity aromatic descriptors. They showed, respectively, values 60 and 43 times higher than unity. Other compounds, such as β-damascenone or β-ionone, which are described as providing floral and herbaceous essences, showed, respectively, odorant activity values 38 and 21 times higher than their perception threshold. All of this led to the wines obtained being characterized by a higher content of compounds related to floral and fruity odorant descriptors. LC, B29 and B6 were the strains that presented the highest amounts of these compounds. When performing cluster and principal component analysis, it was revealed that the wines obtained with the B29 and LC strains were different from the rest, with the floral and herbaceous aromatic series being responsible for that differentiation. In the case of the B6 strain, it was the fruity series that differentiated the wines produced by it, compared to those obtained by the rest of the strains. According to this, the fermentative efficiency of both yeast strains was verified in terms of obtaining wines with different aromatic profiles. From an industrial level viewpoint, it grants the winemaker multiple alternatives to produce wines with specific organoleptic characteristics. The analysis of the proteome of the B6 and LC yeast strains revealed that 80.7% of the expressed proteins were common to both yeasts, both in the presence and absence of SO2. The LC yeast showed no influence of SO2 in its proteome fingerprint and presented the highest intensity of expression of proteins responding to osmotic and oxidative stress in the middle of the fermentation process (7% ethanol (v/v)). This fact was related to its inability to finish fermentation at high sugar concentrations. On the other hand, strain B6 showed higher intensities at the beginning of the process and 48 hours after starting the fermentation, with the influence of SO2 being observed. This fact corresponds to the delay that this strain presented to begin fermentation, although it could later adapt. The research carried out in this work has made it possible to establish a starting point for obtaining a pool of wild yeasts with the best oenological aptitudes to make it available to the wine industry in times of climate change. These findings may contribute to the detection, selection and use of wild yeasts that ferment reliably under stress conditions. With this, a reproducible and sustainable method is presented to combat the adverse climatological effects that the wine sector faces in the medium and short term, without losing, to do so, the identity that characterizes its products.