Study of the epi- / genomic dysregulation of breast cancer in women under 35 years and evaluation of cellular models

El cáncer de mama tiene la tasa de incidencia más alta de todos los cánceres en mujeres en todo el mundo. Este cáncer suele tener un excelente pronóstico con un 80% de supervivencia. Aunque las mujeres menores de 35 años representan el 3-4% del total de casos diagnosticados, sus tumores se caracterizan por ser más grandes, más proliferativos y con una mayor representación de subtipos más agresivos y de peor pronóstico. Las transformaciones neoplásicas se asocian con alteraciones en la metilación del ADN, que incluyen tanto la hipometilación global como la hipermetilación específica. Por otro lado, los miRNAs son pequeñas moléculas no codificantes con un papel importante en la regulación de la expresión génica como parte de la maquinaria epigenética, pero también pueden modificarse epigenéticamente mediante la metilación del ADN. Uno de los objetivos del presente trabajo es establecer un perfil de expresión de miRNAs característico de mujeres menores de 35 años utilizando líneas celulares de cáncer de mama disponibles comercialmente e identificar un buen modelo celular para el estudio del cáncer de mama en mujeres jóvenes. Además, queremos evaluar las diferencias de metilación (metilación global y metilación de genes que codifican miRNAs) entre mujeres jóvenes y mayores con cáncer de mama y evaluar su edad biológica a través del análisis de la metilación del ADN. El perfil de expresión de miRNAs se llevó a cabo utilizando Affymetrix Genechip miRNA 2.0 microarray que incluye 1 100 miRNAs humanos cuya expresión se analizó en 5 líneas celulares de cáncer de mama: HCC1500, HCC1937, MDA-MB-231, MDA-MB-468 y HCC1806. Además, los estudios de metilación del ADN se realizaron con Illumina Human Methylation 850k Beadchip, analizando 21 muestras de mujeres jóvenes y 13 de mayores. Se identificó un perfil de expresión de miRNAs diferente entre líneas celulares de cáncer de mama de mujeres mayores y jóvenes que se comparó con el perfil de miRNAs identificado en pacientes con cáncer de mama. Nuestro estudio nos ha permitido caracterizar las dos líneas celulares de cáncer de mama, HCC1937 y HCC1500, ambas de mujeres jóvenes, como buenos modelos para el estudio del cáncer de mama en pacientes menores de 35 años. Por otro lado, observamos un perfil de metilación diferente entre los grupos de edad, también en las regiones reguladoras de genes que codifican miRNAs. Específicamente, nuestros resultados mostraron una hipometilación global en tumores de mujeres jóvenes, así como una hipermetilación específica, centrada principalmente en las regiones “opensea” del genoma, en pacientes más jóvenes. También encontramos una aceleración en la edad epigenética de los tumores de mujeres jóvenes que podrían aumentar la inestabilidad del genoma. HDAC5 estaba significativamente hipometilado y sobreexpresado en mujeres jóvenes con cáncer de mama. Los estudios funcionales con líneas celulares mostraron una reducción significativa en la proliferación y migración cuando el gen HDAC5 fue inhibido por el inhibidor de HDACi, LMK-235. Esta inhibición fue evidente en los subtipos moleculares triples negativos de ambos grupos de edad. La hipometilación del miR-124-2 se asoció con una peor supervivencia en pacientes con cáncer de mama menores de 35 años en comparación con las mujeres mayores. Las diferencias observadas en pacientes jóvenes con cáncer de mama en nuestro trabajo y otros, refuerzan la hipótesis de que el cáncer de mama que ocurre en mujeres muy jóvenes tiene características biológicas potencialmente únicas, más agresivas y complejas y se deben hacer más esfuerzos para lograr un tratamiento más personalizado.

Breast cancer has the highest incidence rate of all cancers in women worldwide. This cancer usually has an excellent prognosis with an 80% of survival rates. Although women under 35 years of age represent 3-4% of the total cases diagnosed, their tumours are characterized by being larger, more proliferative, and with an overrepresentation of more aggressive subtypes and worse prognosis. Neoplastic transformations are associated with alterations in DNA methylation, including both global hypomethylation and gene-specific hypermethylation. On the other hand, miRNAs are small non-coding molecules of RNA with an important role in the regulation of gene expression as part of the epigenetic machinery, but they can also be epigenetically modified by DNA methylation. One of the aims of the present work is to establish a miRNA expression profile characteristic of women younger than 35 years using breast cancer cell lines commercially available and identify a good cellular model for the study of breast cancer in young women. Moreover, we want to evaluate methylation differences (global methylation and methylation of genes encoding miRNAs) between young and old women with breast cancer and their DNA epigenetic age. The miRNA expression profile was carried out using Affymetrix Genechip miRNA 2.0 microarray that includes 1 100 human miRNAs whose expression was analysed in 5 breast cancer cell lines: HCC1500, HCC1937, MDA-MB-231, MDA-MB-468 and HCC1806. Additionally, DNA methylation studies were performed using the Illumina Human Methylation 850k Beadchip, analysing 21 samples from young women and 13 from older counterparts. We identified a different miRNA expression profile between breast cancer cell lines from old and young women that was compared with the miRNA profile identified in breast cancer patients. Our study has allowed us to characterize the two breast cancer cell lines, HCC1937 and HCC1500, both from young women, as good models for the study of breast cancer in patients younger than 35 years. On the other hand, we observed a different methylation profile between age groups, also in regulatory regions of gene encoding miRNAs. Specifically, our results showed a global hypomethylation in tumours from young women as well as a specific hypermethylation, centred mainly in open-sea regions of the genome in younger patients. We also found an acceleration in the epigenetic age of tumours from young women that could be increasing their genome instability. HDAC5 was significantly hypomethylated and overexpressed in young women with breast cancer. Functional studies with cell lines showed a significant reduction in the proliferation and migration when the HDAC5 gene was inhibited by the HDACi inhibitor, LMK-235. This inhibition was evident in the triple-negative molecular subtypes of both age groups. The hypomethylation of miR-124-2 was associated with poor survival in patients with breast cancer younger than 35 years old compared to older women. The differences observed in young patients with breast cancer in our work and others, reinforce the hypothesis that breast cancer that occurs in very young women has potentially unique, aggressive and complex biological features and more efforts should be done to achieve a more personalized treatment.