Biology of the fire blight pathogen Erwinia amylovora in oligotrophic environments: survival responses and virulence

Erwinia amylovora is a plant pathogenic bacterium of the family Enterobacteriaceae, responsible for fire blight of rosaceous plants. The destructive activity of this pathogen on fruits, flowers and almost all the host plant organs is a major threat for pear and apple production, and causes serious economic losses worldwide. E. amylovora is of quarantine concern in the European Union and other countries pertaining to the European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Spain was considered a protected area with respect to fire blight for many years. However, the disease has finally been established itself in several provinces, while others still maintain a total or partial Protected Zone status. The name “fire blight” refers to the characteristic appearance of affected plants or plant organs, which is black and shriveled as if burnt by fire. The development of these characteristic fire blight symptoms is not dependent on the release of exoenzymes, as occurs in other plant pathogens. In this case, E. amylovora uses the type three secretion system (T3SS) to provoke an oxidative burst and trigger the programmed cell death linked to the hypersensitive response (HR). This strategy is uncommon among plant pathogens, which use the T3SS to avoid this plant response which, in most cases, blocks the progression of pathogens within plant tissues. As a result of E. amylovora infections, however, the HR progresses continuously, and is used by the pathogen to invade neighboring tissues. Therefore, based on this information, antioxidant mechanisms to deal with oxidative stress are necessary for a successful development of symptoms. Siderophores, the lipopolysaccharide (LPS) and the exopolysaccharides (EPSs) amylovoran and levan (important virulence and pathogenicity factors in E. amylovora, respectively) have been linked to the protection of the pathogen against this stress, although the role of EPSs remains unclear due to inconsistent outcomes in different studies. Fire blight outbreaks are irregular and difficult to control, and once E. amylovora is established in an area, the eradication of the disease becomes an arduous task. The disease cycle occurs in parallel with the seasonal development of the host. During spring the pathogen enters the host plant through the nectarthodes in flowers, and other natural openings, and/or wounds in shoots and other susceptible young organs. The movement of E. amylovora within susceptible plants occurs through the intercellular spaces of the cortical parenchyma and xylem vessels. However, the initial multiplication sites within host tissues or the optimal routes allowing the systemic spread of the pathogen are still a subject of discussion. Necrosis, ooze (composed of bacteria in a hygroscopic EPS matrix) and/or wilting are characteristic fire blight symptoms, and can develop in flowers, fruits, shoots, twigs, branches, the trunk and/or the rootstock, hence fire blight is considered a disease of the aerial parts of the plant. Root blight has also occasionally been reported under field conditions, although the primary infection of these organs is not considered an important route for host invasion. Endophytic populations of the pathogen in asymptomatic hosts are usually reported, and their role in fire blight epiphytotics is also still debated. When symptoms are developed, the systemic spread of the pathogen can sometimes lead to the death of the entire host. In general, the most severe infections occur in actively growing host plants, along with the high and low temperatures during summer and winter, leading to a decay in plant growth, usually provoking a slow-down of symptom development. However, in countries with special climatic conditions, the progression of symptoms during winter can also be important. Related to this, the virulence of many plant pathogens is determined by environmental temperatures. In the case of E. amylovora, temperatures of 18-29ºC seem to be necessary for the occurrence of blossom blight outbreaks under field conditions; however, the effect of temperature on the pathogen’s ability to cause disease in susceptible tissues other than flowers has not been assessed. Infections of lignified tissues often lead to the formation of cankers (sunken and usually cracked areas, mainly on the trunk and/or shoots), where the pathogen overwinters. These structures are considered one of the main sources of primary inoculum for the development of fire blight outbreaks. During spring, favorable temperature and humidity conditions allow the multiplication of E. amylovora in cankers, which leads to ooze production. Flies and ants are probably the most important vectors spreading the fire blight pathogen from oozing cankers to other susceptible plants, organs or tissues, while pollinating and piercing-sucking insects seem to play a more relevant role in the secondary dissemination of the pathogen (flower to flower, shoot to shoot, etc). Wind, wind-driven rain and/or birds also contribute greatly to the dissemination of bacterial cells from oozing cankers to other susceptible tissues, organs and hosts. In diseased plants the presence of epiphytic populations of the pathogen on leaves or other plant surfaces is favored by certain environmental conditions. Moreover, E. amylovora is able to survive in soil, insects, or on pruning tool surfaces. The persistence of this and other non-obligated pathogens outside the host is compromised by their tolerance and/or adaptation to the starvation conditions prevailing in nature. Temperature is another key factor directly affecting the survival of microorganisms in natural environments. However, its effects vary depending on the nutritional state of cells, and temperatures promoting cell multiplication under optimal nutrient conditions might be deleterious for starved cells. How E. amylovora deals with starvation or the effects of temperature on the pathogen survival under natural nutrient limiting conditions is still a scarcely explored subject. Two common responses of nonsporulating bacteria to environmental oligotrophy, strongly influenced by temperature, are the starvation-survival and the viable but nonculturable (VBNC) states. These two survival strategies determine the life cycle and disease development in many plant and animal bacterial pathogens. The physiology of bacterial cells developing the starvation-survival response has many similarities to that of cells in stationary-phase. Bacteria in this state experience changes in morphology, cell size, motility, biochemical composition, gene expression, develop cross-resistance to multiple stresses, etc., in order to adapt to this new nutrient limiting condition. As opposed to bacteria in the starvation-survival state, bacterial cells adopting the VBNC state lose their ability to form colonies on solid conventional media, and they also usually lose their pathogenicity, but remain metabolically active. Apart from environmental nutrient scarcity, other stresses can induce the VBNC response. The recovery of both culturability and pathogenicity in VBNC cells can occur after removing the stressing agent, by incubation in rich medium, by exposure to certain resuscitation factors secreted by some bacterial species, and/or by passage through a susceptible host. In E. amylovora, for example, cells become VBNC after exposure to copper, and this response is accompanied by a loss of pathogenicity in immature fruits. The recovery of culturability and pathogenicity is possible throug a variety of strategies, but the intensity of treatments and/or the elapsed period since the onset of the VBNC response may determine the success of the recovery. In many bacterial species the molecular mechanisms controlling adaptation to nutrient limiting environments and/or the entry into the stationary-phase involve the participation of the alternative sigma factor RpoS. This protein changes the transcription patterns of the RNA polymerase, favoring the expression of genes related to metabolism, stress resistance, etc., which enhance the survival of the challenged bacterial cells in these new conditions. In some bacterial species, RpoS has also been described as being able to control virulence. The regulation of virulence can occur directly, via the control of virulence genes, or also indirectly, by modulating the genes involved in the survival of the pathogen under host conditions. Given that starvation is one of the main VBNC-inducing stresses, RpoS might also be linked to the regulation of this survival response, although there is still little information in this regard. Interestingly, RpoS controls genes related to oxidative stress resistance, and the loss of catalase activity has been reported as an important factor determining culturability on solid media in starved cells. In the case of E. amylovora, the potential roles of RpoS in the regulation of the starvation-survival and the VBNC responses have not yet been investigated. Moreover, the control exerted by this master regulator on virulence/pathogenicity factors such as motility, or EPS synthesis in the fire blight pathogen is still unknown. Furthermore, despite the fact that a link response has been established between oxidative stress, catalase activity and the development of the VBNC, mainly by indirect observations, the exact contribution of catalases to the VBNC phenotype has never been explored in E. amylovora, nor in any other bacterial pathogens. In addition, the contribution of catalases to E. amylovora virulence has not yet been assessed. There are still many aspects of the E. amylovora life cycle that remain poorly understood. The main objective of this Doctoral Thesis was focused on the characterization of the mechanisms allowing E. amylovora to adapt to natural nutrient limitation conditions, which are responsible for the pathogen’s persistence in the environment, and its spread by water, vector insects, etc. The main objective of this Doctoral Thesis can be specified in the following partial objectives: 1. Characterize E. amylovora’s responses to starvation, as well as the effect of environmental temperatures on these responses and virulence. 2. Investigate the survival and transmission of E. amylovora by the medfly Ceratitis capitata. 3. Determine the potential water-borne infection of Pyrus communis plants by E. amylovora through the roots by soil-irrigation, and characterize the root colonization, invasion and migration routes of the pathogen. 4. Study the role of the alternative sigma factor RpoS in the development of starvation-survival responses by E. amylovora, as well as characterize its functions as a regulator of cross-protection, virulence factors and virulence in different types of plant material. 5. Explore the functional roles of the E. amylovora catalases KatA and KatG during exposure to nutrient limiting conditions and also during plant-pathogen interactions. To reach these objectives different studies were performed leading to the publication of four scientific articles (Annex I, III, IV, VI) and the preparation of three additional manuscripts that will be submitted shortly (Annex II, V, VII). The results from all these studies are collected and summarized in five chapters in this Doctoral Thesis. Chapter 1 summarizes the results of three publications (Annex I, II and III). In all of them oligotrophic water microcosms were prepared, inoculated with E. amylovora and incubated at one or more environmental temperatures, ranging from 4ºC to 28ºC. In Article 1 (Annex I; Santander et al., 2014b) temperature conditions favoring the maintenance of culturability over time were selected to further analyze possible morphological, motility, gene expression and virulence changes occurring during the exposure of E. amylovora to starvation. Part of this study was performed in the Faculty of Biology, in the University of North Carolina at Charlotte (USA). In Article 2 (Annex II; Santander & Biosca, 2016, unpublished), the effect of incubation at low, temperate and warm temperatures on morphology, cell size, virulence and some phenotypic traits related to the survival and/or virulence of E. amylovora was also investigated. Finally, Article 3 (Annex III; Santander et al., 2012a) was focused on the induction of the VBNC response in E. amylovora by exposure to starvation or chlorine, in order to test several methodologies to recover VBNC cells. The main results in this chapter are: i) Temperatures between 14ºC and 20ºC favor the maintenance of E. amylovora starved cells in a culturable state, while temperatures above or below this range induce the VBNC response. Higher temperatures (>20ºC) induce a loss of viability not observed at lower temperatures (<14ºC). ii) Long-term starved E. amylovora cells acquire coccoid shapes, reduce their size (dwarfing), develop outer membrane vesicles and lose motility, although some flagella remain attached to the cell surface. Changes in cell size but not in morphology are also dependent on temperature, with dwarfing being favored at 14ºC with respect to 4ºC or 28ºC. iii) E. amylovora cells in the starvation-survival state modulate the expression of genes related to starvation (cstA, dps, relA, rpoS, spoT), virulence or pathogenicity (flgN, hrpL, rcsB, rlsA) and oxidative stress resistance (katA, katG, oxyR), to reach stable levels in short periods after the exposure to starvation conditions. The levels of mRNA of these genes were detectable throughout a starvation period of 40 days. iv) E. amylovora cells in the starvation-survival state are pathogenic in immature fruits (loquats and pears) and in pear plantlets. On the contrary, starvation- and chlorine-induced VBNC cells lose pathogenicity together with pathogenicity on immature fruits over time. However, these VBNC cells can recover their culturability and pathogenicity on immature fruits by passage through pear plantlets. v) E. amylovora is pathogenic at 4ºC, 14ºC and 28ºC, and virulence decreases in parallel with incubation temperature. Growth rates in rich medium, motility and siderophore secretion also decreased along with incubation temperatures. By contrast, other virulence/pathogenicity factors were induced at temperatures below 28ºC. The EPSs amylovoran and levan, for example, were overproduced at 4ºC and 14ºC, respectively. Incubation of cells at 14ºC also enhanced biofilm formation and hydrogen peroxide (H2O2) resistance, with respect to 4ºC or 28ºC. Chapter 2 contains results from a publication on E. amylovora survival in the Mediterranean fruit fly, or medfly, C. capitata, and on its potential transmission by this insect (Annex IV; Ordax et al., 2015). This work was a collaboration with Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA, Spain). C. capitata, is a common pest in pear and apple orchards, which has been described as a potential vector for human pathogens. Hence, it might also develop an important role in host-to-host transmission and the long distance dispersal of E. amylovora. For an insect to act as a vector of a plant pathogen, the latter has to be able to survive in/on the insect, and the insect has to be able to transmit the pathogen to susceptible plant material. In order to monitor the survival of E. amylovora in/on medflies and the potential of these insects to transmit the pathogen, groups of medflies were exposed to apples contaminated with the pathogen over 48 h in cages. Afterwards the insects were transferred to new cages with artificial food (to monitor E. amylovora survival over time) or containing susceptible plant material such as fruits, shoots or potted plants (to monitor E. amylovora transmission by the medflies). Survivability was monitored on solid media. When plate counts decreased below the detection limit, the possible survival of E. amylovora in the VBNC state was tested by inoculating medfly extracts in susceptible plant material. In transmission experiments, transmission events were considered positive when fire blight symptoms were observed in the plant material exposed to the flies and/or by the isolation of E. amylovora cells from such material on culture media. Survival and location of E. amylovora in/on insects was also analyzed by using E. amylovora strains labeled with the green fluorescent protein GFP, or the red fluorescent protein DsRed followed by epifluorescence microscopy (EFM) analysis. The main results in this chapter are: i) E. amylovora can be acquired by, and survive on/in medflies, for at least, 28 days with the detection of the pathogen on solid media being possible during the first 14 days. In the following two weeks, the pathogen was not isolated by culture-dependent procedures, but the inoculation of medfly extracts into susceptible plant material led to the development of fire blight symptoms, indicating the presence of E. amylovora cells in the VBNC state. ii) The medfly C. capitata is able to transmit E. amylovora to different types of plant material. EFM analysis of medflies exposed to GFP-tagged bacteria led to the conclusion that plant surfaces are contaminated by contact with E. amylovora cells forming aggregates and biofilm-like structures on insect surfaces (mainly on the distal section of wings and the abdomen, as well as on the ovipositor surface of female medflies). The transmission via faeces containing E. amylovora cells previously ingested cannot be discarded. Female medflies, additionally, are able to inoculate E. amylovora cells inside susceptible plant tissues while using the ovipositor. iii) E. amylovora persists 8 days within medflies. The EFM analysis of vibratom sections of medflies exposed to DsRed-tagged E. amylovora cells revealed that the pathogen can be internalized by feeding, with bacterial cells being located in internal parts of the mouth and the crop, but mainly in the digestive tube. In Chapter 3 the results of an unpublished work on the feasibility of the water-borne root infection of P. communis by E. amylovora are summarized (Annex V; Santander et al., 2016, unpublished). To conduct this study, we first adapted a protocol to obtain pear plantlets by in vitro culture of embryos. To determine E. amylovora’s ability to migrate from roots to upper parts of the plant, we first carried out direct root inoculation assays. Afterwards, we performed inoculations of plants with intact versus wounded roots (by transplanting) by means of soil irrigation with E. amylovora contaminated water. The stages of root infection, and the migration pathways of the pathogen within host tissues, were characterized using a GFP-tagged strain together with EFM and LSCM analysis. The main results of this work are: i) The in vitro culture of pear embryos allows the germination of long-term stored pear seeds, which are difficult to germinate by standard procedures. ii) The inoculation of E. amylovora into the roots of pear plantlets leads to the development of fire blight symptoms in the aerial part of the plant, far from the inoculation site. iii) Water-borne infection of P. communis roots by E. amylovora is possible under laboratory conditions, leading to the development of characteristic fire blight symptoms (in stem, leaves and petioles) in 20 % and 52.5 % of the inoculated intact and transplanted plants, respectively. iv) The stages of root colonization followed by E. amylovora are very similar to those described in well-known soil-borne plant pathogens. The entry of the pathogen into the radicular system occurs via wounds and/or cracks at the site of emergence of secondary roots. Bacterial cells multiply within the intercellular spaces of the cortex, reach the vascular system and migrates through xylem vessels to the aerial parts of the plant, where they are able to generate typical fire blight symptoms. In Chapter 4, results from a study on the role of the sigma factor RpoS in E. amylovora responses to starvation, cross-protection, motility and the production of EPS, and virulence are summarized (Annex VI; Santander et al., 2014a). Part of this work was performed at Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP, Spain). To this aim, an E. amylovora mutant in the rpoS gene together with the corresponding complemented strain were obtained and characterized along with the wild type strain. The results of this study are: i) The E. amylovora mutant in the rpoS gene showed defective development of starvation responses, with a faster induction of the VBNC response, accompanied by a loss of viability and cell lysis not observed in the wild type strain. ii) In E. amylovora, the alternative sigma factor RpoS is required for full stationary-phase cross protection against osmotic, acid and oxidative stresses, and it is essential for a heat-shock response; however, apparently is not required for acid shock resistance. iii) RpoS enhances E. amylovora survival in non-host tissues, and a mutation in the rpoS gene leads to an increase in virulence in immature fruits, a significant increase in levan production, a slight decrease in amylovoran production, and a reduction of swimming motility. Finally, in Chapter 5 results of an unpublished study on the role of the E. amylovora catalases KatA and KatG during responses to starvation and plant-pathogen interactions are summarized (Annex VII; Santander et al., 2016, unpublished). To this purpose, E. amylovora single and double catalase mutants were constructed, together with the corresponding complemented strains. The different assays carried out to characterize the functional roles of these catalases included: expression studies, in vivo and in vitro measurements of catalase activity, detection of catalase isozymes by zymography after native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), identification of catalases by liquid chromatography – mass spectrometry (LC-MS/MS), determination of culturable, viable and total cell population kinetics, growth inhibition assays, survival experiments in non-host tissues and virulence assays. The results obtained in this work are: i) E. amylovora catalase genes katA and katG are induced in the stationary and exponential growth phase, respectively. Both genes are also induced in the presence of H2O2 and in host tissues. The analysis of catalase activity revealed that KatA accounts for most of the catalase activity in E. amylovora cells. KatA and KatG were the only sources of catalase activity in E. amylovora. ii) The detection of KatA, but not KatG can be achieved by standard zymography and LC_MS/MS after native PAGE. iii) KatA, followed by KatG are required for full protection against H2O2 and menadione. iv) The absence of catalase activity in the E. amylovora double catalase mutant induces a faster development of the starvation-induced VBNC response. This phenomenon is not observed in the single catalase mutants or the wild type strain, which behave similarly. The addition to catalase to solid media, or the complementation of mutants with a functional copy of catalase genes improves culturability of starved cells. v) The E. amylovora catalases are required for full survival in non-host tissues. In susceptible plants, KatA and KatG play different roles during infections, with KatG probably being involved in the onset of symptoms and KatA in the progression of bacterial cells throughout host tissues.   The main conclusions of this Doctoral Thesis can be summarized as: 1) Temperate environmental temperatures (14ºC – 20ºC) favor the persistence of E. amylovora starved cells in a culturable state, with warmer or lower temperatures inducing a progressive entry into the VBNC state, and low temperatures, moreover, enhancing a greater maintenance of viability. Adaptations to starvation include morphological changes, dwarfing, modulation of motility and gene expression, with temperature further modulating changes in cell size. 2) E. amylovora starved cells are pathogenic. By contrast, the starvation- or chlorine-induction of the VBNC response leads to a loss of pathogenicity on immature fruits which can be reverted by inoculation into susceptible pear plantlets. 3) Under controlled conditions, E. amylovora remains pathogenic even at low incubation temperatures, with many virulence factors also being induced at temperatures below the optimal for growth. 4) E. amylovora survives in C. capitata for, at least, 28 days and insect conditions induce the entry of the pathogen into the VBNC state. Bacterial cells form aggregates and/or biofilm-like structures on the insect’s surface (on the distal part of wings, the abdomen and the ovipositor), but can also persist within the insect for 8 days (internal parts of the mouth, the crop and the digestive gut). 5) The E. amylovora transmission by C. capitata occurs mainly through the contact of the medfly with plant surfaces, although female medflies can directly inoculate E. amylovora into plant material with the ovipositor. These results suggest that C. capitata can act as a potential vector for E. amylovora. 6) E. amylovora is able to invade pear plantlets through the roots, with normal fire blight symptoms being developed in the aerial part of the plant. Under controlled conditions, root infection of pear plantlets by soil-irrigation with E. amylovora contaminated water is feasible, with infection percentages increasing in plants with damaged roots. The E. amylovora root infection stages are very similar to those of well-known soil-borne plant pathogens. 7) The sigma factor RpoS contributes to the maintenance of culturability and viability in E. amylovora starved cells. It is also required for full stationary-phase cross protection against a variety of stresses which the pathogen can encounter in nature, and for proper survival of E. amylovora in non-host tissues. RpoS also modulates virulence and pathogenicity factors and virulence in immature fruits 8) The E. amylovora catalases KatA and KatG are differently regulated by growth phase, induced by exposure to H2O2 and host tissues and possess different specific catalase activities, indicating differentiated functional roles for each catalase. Both of them contribute to the maintenance of culturability in E. amylovora starved cells, delaying the entry into the VBNC state. Furthermore, they contribute to the pathogen’s survival in non-host tissues, and are required for full virulence in immature fruits. Overall, the research carried out in this Doctoral Thesis provides new knowledge of the mechanisms allowing the E. amylovora survival in environments outside the host. Results in this Thesis suggest that the starvation-survival and the VBNC responses are part of the E. amylovora’s life cycle, contributing to its persistence in the environment and probably determining the development of fire blight in field conditions. Furthermore, E. amylovora’s adaptations to survive outside the host, be transmitted by different means, and remain pathogenic at a wide range of temperatures, something which has probably contributed to its spread to a variety of countries worldwide, in different climatic areas. Finally, the results in this Doctoral Thesis may provide clues to help improve the control of fire blight and/or preventive measures against it.

Erwinia amylovora es una bacteria fitopatógena de la familia Enterobacteriaceae, responsable del fuego bacteriano de las rosáceas. Los efectos destructivos de este patógeno sobre frutos, flores y prácticamente todos los órganos de las plantas hospedadoras afectadas constituyen una amenaza importante para la producción de pera y manzana, y suponen graves pérdidas económicas anuales en todo el mundo. E. amylovora está clasificada como un organismo de cuarentena en la Unión Europea y en otros países pertenecientes a la EPPO (del inglés, European and Mediterranean Plant Protection Organization). España, ha sido considerada durante muchos años como un área protegida de fuego bacteriano por la Unión Europea. No obstante, dicha enfermedad ha acabado estableciéndose en muchas provincias, mientras que otras mantienen, total o parcialmente, el estatus de Zona Protegida. El nombre fuego bacteriano se refiere al aspecto ennegrecido, como quemado por el fuego, característico de las plantas u órganos afectados por E. amylovora. A diferencia de otras bacterias fitopatógenas, esta sintomatología no es dependiente de la liberación de exoenzimas. E. amylovora utiliza el sistema de secreción de tipo tres (SST3) para inducir el estallido oxidativo y la muerte celular programada de las células vegetales asociada la respuesta hipersensible (HR, del inglés, Hypersensitive Response). Esta estrategia es inusual entre las bacterias patógenas de plantas, que precisamente utilizan el SST3 para evitar el estallido oxidativo y la HR, que son sistemas de defensa del hospedador para bloquear la progresión de los patógenos dentro de los tejidos vegetales. E. amylovora debe poseer, por lo tanto, mecanismos antioxidantes para lidiar con el estrés oxidativo provocado durante su avance por los tejidos. Algunos elementos que se han relacionado con la protección de este patógeno frente al estrés oxidativo son los sideróforos, el lipopolisacárido (LPS) y los exopolisacáridos (EPSs), aunque el papel de éstos últimos ha sido discutido debido a resultados dispares en distintos trabajos. Los brotes de fuego bacteriano son irregulares y difíciles de controlar y, una vez el patógeno se ha establecido en una zona, la erradicación de la enfermedad resulta compleja. El ciclo del fuego bacteriano ocurre en paralelo al desarrollo estacional de la planta hospedadora. Durante la primavera E. amylovora entra en el hospedador a través de los nectarios en las flores, así como otras aberturas naturales y/o heridas en brotes y otros órganos susceptibles. El movimiento de E. amylovora dentro de la planta se produce a través de los espacios intercelulares del parénquima cortical y los haces del xilema. A día de hoy, aún no existe consenso entre los investigadores sobre cuáles son los sitios iniciales de multiplicación del patógeno dentro del hospedador, o las rutas óptimas para la infección sistémica del mismo. Los síntomas más característicos del fuego bacteriano son la necrosis, los exudados (compuestos por bacterias inmersas en una matriz de EPSs) y el marchitamiento. Dichos síntomas pueden desarrollarse en flores, frutos, brotes, ramas, el tronco y/o el portainjerto, por lo que el fuego bacteriano se considera principalmente una enfermedad de la parte aérea de las plantas. En algunas ocasiones se han detectado signos de fuego bacteriano en raíces, en condiciones de campo. No obstante, la infección primaria de las raíces no se considera una vía importante para la infección del hospedador. E. amylovora puede detectarse también como organismo endófito en plantas asintomáticas, aunque el papel de las poblaciones endófitas en las epidemias de fuego bacteriano se desconoce. En plantas enfermas el avance de los síntomas puede acabar matando la planta entera. En general, las infecciones más graves se producen en los periodos en los que el hospedador presenta un crecimiento activo. Las altas y bajas temperaturas durante el verano y el invierno, respectivamente, conducen a la aminoración del crecimiento de las plantas, lo que suele provocar una ralentización del desarrollo de los síntomas de fuego bacteriano. Sin embargo, en países con condiciones climáticas especiales, la progresión de los síntomas durante el invierno puede ser también importante. En relación a esto, la virulencia de muchas bacterias fitopatógenas en campo está determinada por las temperaturas ambientales. En el caso de E. amylovora, son necesarias temperaturas ambientales de 18-29ºC para el desarrollo de brotes de fuego bacteriano en flores. No obstante, el efecto de la temperatura sobre la capacidad del patógeno para causar síntomas en tejidos sensibles, distintos a las flores, no ha sido evaluada. La infección de tejidos lignificados suele conducir a la formación de chancros (zonas hundidas y usualmente agrietadas que aparecen, generalmente, en el tronco y/o las ramas), en los que el patógeno sobrevive durante el invierno. Estas estructuras se consideran una de las principales fuentes de inóculo primario para el desarrollo de brotes de fuego bacteriano. Durante la primavera, las condiciones de temperatura y humedad favorables permiten la multiplicación de E. amylovora en los chancros, lo que favorece la producción de exudados. Las moscas y las hormigas son probablemente los vectores más importantes para la propagación del patógeno desde chancros con exudados a otras plantas, órganos o tejidos susceptibles. Los insectos polinizadores y perforadores parecen jugar un papel más importante en la diseminación secundaria de E. amylovora (de flor a flor, de brote a brote, etc). El viento, la lluvia y las aves también contribuyen de forma importante a la diseminación de las células del patógeno. En plantas enfermas la presencia de poblaciones epífitas de E. amylovora en hojas o la superficie de otros órganos se ve favorecida por ciertas condiciones ambientales. E. amylovora también es capaz de sobrevivir en suelo, insectos, o herramientas de poda. La persistencia de este y otros patógenos no obligados en ambientes fuera del hospedador depende de su tolerancia y/o adaptación a las condiciones de inanición que prevalecen en la naturaleza. La temperatura es otro factor ambiental que afecta directamente a la supervivencia de los microorganismos en el medio ambiente. Sin embargo, sus efectos varían en función del estado nutricional de las células, y las temperaturas que promueven la multiplicación celular en condiciones nutricionales óptimas pueden ser perjudiciales para células en estado de inanición. Las estrategias de E. amylovora para sobrevivir en condiciones naturales de limitación nutricional, así como los efectos de la temperatura sobre dichos mecanismos aún no han sido caracterizados. Dos respuestas características de las bacterias no esporuladas a la oligotrofía ambiental son la supervivencia en estado de inanición y el estado viable no cultivable (VBNC, del inglés viable but nonculturable). El desarrollo de ambas estrategias está fuertemente influido por la temperatura, y en muchos casos, determina el ciclo de vida, así como el de la enfermedad de muchos patógenos de animales y de plantas. El estado fisiológico de las células en estado de supervivencia en inanición tiene muchas similitudes con el de las células en fase estacionaria. En ambos casos, las bacterias experimentan cambios en la morfología y tamaño celular, la movilidad, la composición bioquímica, la expresión génica, desarrollan resistencia cruzada a múltiples factores de estrés, etc., lo que les permite adaptarse a las nuevas condiciones nutricionales. A diferencia de las células en estado de supervivencia en inanición, las bacterias en estado VBNC pierden la capacidad para formar colonias en medio de cultivo sólido y, por lo general, también la patogenicidad. No obstante, las células en estado VBNC siguen siendo metabólicamente activas. Además de la inanición, otros tipos de estrés pueden inducir la respuesta VBNC. Tanto la cultivabilidad como la patogenicidad en células VBNC pueden recuperarse mediante la eliminación del agente estresante, la incubación en medio rico líquido, la exposición a ciertos factores de resucitación secretados por algunas especies de bacterias, y/o mediante el pase a través de un hospedador susceptible. E. amylovora, por ejemplo, entra en el estado VBNC y pierde la patogenicidad en frutos inmaduros tras la exposición a cobre. La recuperación de la cultivabilidad y la patogenicidad puede lograrse mediante diversas estrategias, aunque la intensidad de los tratamientos y/o el período transcurrido desde el inicio de la respuesta VBNC determinan el éxito de dicha recuperación. En muchas especies bacterianas los mecanismos moleculares que controlan la adaptación a la limitación nutricional y/o la entrada en la fase estacionaria implican la participación del factor sigma alternativo RpoS. Tras la exposición de las células a condiciones de inanición u otros estreses, esta proteína se une a la ARN polimerasa y modifica los patrones de transcripción, favoreciendo la expresión de genes relacionados con el metabolismo, la resistencia al estrés, etc., que posibilitan la supervivencia de las células bacterianas en estas nuevas condiciones. En muchas especies bacterianas, RpoS también regula genes de virulencia. Dicha regulación puede ser directa, a través del control de genes de virulencia, o también indirecta, mediante la modulación de genes implicados en la supervivencia del patógeno dentro del hospedador. Dado que el estrés por inanición es uno de los principales factores de inducción del estado VBNC, el factor sigma RpoS también podría estar relacionado con la regulación de esta respuesta de supervivencia, aunque todavía existe poca información al respecto. Curiosamente, RpoS controla genes relacionados con la resistencia al estrés oxidativo, y la disminución progresiva de actividad catalasa se ha relacionado con la pérdida de cultivabilidad en medios sólidos durante la entrada en el estado VBNC. La posible contribución de RpoS en la regulación de los estados de supervivencia en inanición y VBNC en E. amylovora aún no ha sido investigada. Por otra parte, también se desconoce el papel de RpoS en la regulación de importantes factores de virulencia/patogenicidad como la movilidad o la síntesis de EPS. Finalmente, aunque distintos estudios sugieren la relación entre el estrés oxidativo, la actividad catalasa y el desarrollo de la respuesta VBNC, la conexión entre dichos factores se ha establecido, en la mayoría de los casos, de forma indirecta y se desconoce la contribución exacta de las catalasas al fenotipo VBNC. La contribución de las catalasas a la virulencia de E. amylovora tampoco se ha estudiado todavía. De acuerdo con lo anteriormente mencionado, muchos aspectos de la biología de E. amylovora aún siguen siendo poco conocidos, aunque de su estudio podrían derivarse mejoras en las estrategias de prevención y control del fuego bacteriano. En base a esto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido caracterizar los mecanismos de adaptación de E. amylovora a condiciones naturales de inanición, los cuales serían responsables de la capacidad del patógeno para persistir en el ambiente y diseminarse a través del agua, vectores, etc. Este objetivo global, puede subdividirse en los siguientes objetivos particulares: 1. Caracterizar las respuestas de E. amylovora a la limitación nutricional, así como el efecto de la temperatura en dichas respuestas y la virulencia del patógeno. 2. Investigar la supervivencia y la transmisión de E. amylovora a través de la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata. 3. Determinar la posible infección de plantas de Pyrus communis por E. amylovora a través de las raíces mediante riego y caracterizar las rutas de colonización e invasión de la raíz. 4. Estudiar el papel de RpoS en el desarrollo de las respuestas a condiciones de inanición en E. amylovora, y caracterizar la participación de este regulador en la protección cruzada, el control de factores de virulencia, o la virulencia en diferentes tipos de material vegetal. 5. Explorar el papel funcional de las catalasas KatA y KatG de E. amylovora durante la exposición a condiciones limitantes en nutrientes y las interacciones planta-patógeno. Para alcanzar estos objetivos se llevaron a cabo diferentes estudios, lo que ha llevado a la publicación de cuatro artículos científicos (anexo I, III, IV, VI) y la preparación de tres manuscritos adicionales que han sido o serán enviados a publicar en breve (anexo II, V, VII). Los resultados de estos estudios se recopilan en los cinco capítulos que forman parte de esta Tesis Doctoral. El Capítulo 1 resume los resultados de tres publicaciones (Anexo I, II y III). En todas ellas se prepararon microcosmos de agua oligotrófica de distintos tipos, que se inocularon con E. amylovora e incubaron a una o más temperaturas ambientales, entre 4ºC y 28ºC. En el artículo 1 (Anexo I; Santander et al., 2014b) se seleccionaron condiciones de temperatura que favorecieran el mantenimiento de la cultivabilidad en E. amylovora, con el fin de analizar los efectos de la inanición sobre la movilidad, la expresión de genes de virulencia, la morfología o la virulencia. Parte de este estudio se llevó a cabo en la Facultad de Biología de la Universidad de Carolina del Norte en Charlotte (EEUU). En el artículo 2 (Anexo II; Santander & Biosca, 2016, no publicado) también se investigó el efecto de distintas temperaturas (4ºC, 14ºC y 28ºC) sobre las respuestas de E. amylovora a inanición, así como sobre la morfología, el tamaño celular, la virulencia y algunos rasgos fenotípicos relacionados con la supervivencia y/o virulencia. Por último, el artículo 3 (Anexo III; Santander et al., 2012a) se centró en el estudio de la respuesta VBNC inducida por condiciones de inanición y por exposición a cloro, así como de las condiciones que favorecen la recuperación de dichas células. Los principales resultados de este capítulo son: i) Las temperaturas entre 14ºC y 20ºC favorecen el mantenimiento de la cultivabilidad en células de E. amylovora sometidas a condiciones de inanición, mientras que temperaturas por encima o por debajo de este rango inducen la respuesta VBNC. Esta respuesta implica cierta pérdida de viabilidad a temperaturas por encima de 20ºC. Dicha reducción de viabilidad no se observa durante la entrada en el estado VBNC a temperaturas por debajo de 14ºC. ii) La exposición de E. amylovora a condiciones de inanición por periodos prolongados induce la adquisición de forma cocoide, una reducción de tamaño (dwarfing), el desarrollo de vesículas de superficie y la pérdida de movilidad, aunque algunos flagelos permanecen unidos a la superficie celular. Los cambios de tamaño, pero no los de morfología, también son dependientes de la temperatura, viéndose favorecidos a 14ºC con respecto a 4ºC o 28ºC. iii) La exposición de E. amylovora a condiciones de inanición induce cambios en la expresión de genes relacionados con las respuestas a inanición (cstA, dps, relA, rpoS, spoT), la virulencia o patogenicidad (flgN, hrpL, rcsB, rlsA) y la resistencia al estrés oxidativo (katA, katG, oxyR). Los niveles de ARNm de estos genes son detectables a lo largo de un período de inanición de 40 días. iv) Las células de E. amylovora en estado de supervivencia en inanición son patógenas en frutos inmaduros (peras y nísperos) y plántulas de peral. Sin embargo, tras la inducción del estado VBNC mediante inanición o exposición a cloro se observa la pérdida tanto de cultivabilidad como de patogenicidad en frutos inmaduros. No obstante, estas células VBNC pueden volver a ser cultivables y patógenas en frutos inmaduros tras su pase a través de plántulas de peral. v) E. amylovora es patógena a 4ºC, 14ºC y 28ºC. La virulencia disminuye en paralelo a la temperatura de incubación. De forma similar, las tasas de crecimiento en medio rico, la movilidad y la secreción de sideróforos también disminuyen junto con las temperaturas de incubación. Sin embargo, otros factores de virulencia/patogenicidad se inducen a bajas temperaturas. Por ejemplo, la producción de amilovorano y levano se incrementa a 4ºC y 14ºC, respectivamente. La incubación a 14ºC también favorece la formación de biopelículas y la resistencia a peróxido de hidrógeno (H2O2), con respecto a 4ºC o 28ºC. El Capítulo 2 contiene los resultados de una publicación sobre la supervivencia y transmisión de E. amylovora por la mosca mediterránea de la fruta C. capitata (Anexo IV; Ordax et al., 2015), que se realizó en colaboración con el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA, España). C. capitata es una plaga común en los huertos de manzanos y perales, y ha sido descrita como un vector potencial de patógenos humanos, por lo que también podría desarrollar un papel importante en la diseminación y transmisión de E. amylovora a nuevos hospedadores. Una condición imprescindible para que un insecto pueda transmitir un patógeno es que dicho patógeno sea capaz de sobrevivir en el insecto y que dicho insecto sea capaz de transmitir el patógeno a un hospedador susceptible. Con el fin de determinar la supervivencia de E. amylovora en/sobre la mosca de la fruta, grupos de insectos se expusieron durante 48 h a manzanas contaminadas con E. amylovora en el interior de jaulas. Posteriormente, dichos insectos fueron trasladados a nuevas jaulas con comida artificial (para determinar la supervivencia del patógeno a lo largo del tiempo) o con material vegetal susceptible como frutos, brotes o plántulas (para estimar la capacidad de transmisión de E. amylovora por C. capitata). La supervivencia de E. amylovora se evaluó mediante recuentos en placa. Cuando dichos recuentos disminuyeron por debajo de los niveles de detección, la posible existencia de células VBNC se evaluó mediante la inoculación de extractos de mosca en material vegetal susceptible. Durante los ensayos de transmisión, tanto el desarrollo de síntomas de fuego bacteriano en el material vegetal expuesto a las moscas como el aislamiento de E. amylovora de la superficie de dicho material en medios de cultivo fueron considerados como eventos de transmisión positivos. La supervivencia y localización de E. amylovora en/sobre los insectos también se analizó mediante el uso de cepas transformantes de E. amylovora marcadas con la proteína verde fluorescente GFP, o la proteína roja fluorescente DsRed, y su posterior análisis por microscopía de epifluorescencia (EFM). Los principales resultados de este capítulo son: i) E. amylovora puede ser adquirida por C. capitata y sobrevivir en el insecto durante, al menos, 28 días. La detección del patógeno en medio sólido sólo fue posible durante los primeros 14 días. Las dos semanas siguientes E. amylovora dejó de detectarse en medio de cultivo, aunque la inoculación de extractos de C. capitata en material vegetal susceptible indujo el desarrollo de síntomas de fuego bacteriano, indicando la presencia de células de E. amylovora en el estado VBNC. ii) C. capitata es capaz de transmitir E. amylovora a diferentes tipos de material vegetal. La contaminación de la superficie de las plantas expuestas a las moscas ocurre por el contacto de las mismas con células de E. amylovora, que forman agregados y biopelículas sobre las moscas (principalmente sobre la parte distal de las alas, el abdomen y, en el caso de las hembras, también sobre el ovopositor). La transmisión de E. amylovora a través de heces con células del patógeno previamente ingeridas por la mosca no se descarta. Las hembras de C. capitata, además, son capaces de inocular células de E. amylovora en el interior de tejidos vegetales susceptibles mediante el ovopositor. iii) Tras la adquisición del patógeno, E. amylovora persiste 8 días dentro de la mosca de la fruta. El análisis por EFM de secciones hechas con vibratomo de moscas expuestas a cepas de E. amylovora transformantes de color rojo fluorescente reveló la internalización del patógeno mediante la alimentación. Se detectaron células de E. amylovora en las partes internas de los órganos bucales, el buche y el tracto digestivo. En el Capítulo 3 se detallan los resultados de un trabajo no publicado sobre la viabilidad de la transmisión por el agua e infección de P. communis por E. amylovora a través de las raíces (anexo V; Santander et al., 2016, no publicado). Para llevar a cabo este estudio, se adaptó un protocolo para la obtención de plántulas de peral por cultivo in vitro de embriones. Para determinar la capacidad de E. amylovora para migrar desde las raíces hasta las partes superiores de la planta, se realizó primero un ensayo de inoculación directa en raíz. Posteriormente se ensayó la inoculación por riego de plantas intactas y plantas con las raíces dañadas por trasplante, utilizando agua contaminada con E. amylovora. Las etapas de la infección de las raíces y las rutas de migración del patógeno dentro de los tejidos del hospedador se caracterizaron utilizando una cepa de E. amylovora marcada con GFP y análisis por EFM y microscopía laser confocal (LSCM, del inglés Laser Scanning Confocal Microscopy). Los principales resultados de este trabajo son: i) El cultivo in vitro de embriones de peral permite la germinación de semillas almacenadas a largo plazo, que son difíciles de germinar mediante procedimientos estándar. ii) La inoculación directa de E. amylovora en las raíces de plántulas de peral permite la invasión sistémica de la plántula por el patógeno, que es capaz de generar síntomas de fuego bacteriano en la parte aérea de la planta, lejos del sitio de inoculación. iii) La infección de raíces de P. communis por E. amylovora a través del agua de riego es posible en condiciones controladas. Los porcentajes de plantas con síntomas fueron del 52.5% en el caso de plantas con heridas en las raíces (por trasplante), y del 20% en el caso de plantas intactas. Las plantas desarrollaron síntomas de fuego bacteriano en el tallo, las hojas y los pecíolos. iv) Las fases de la colonización de las raíces por E. amylovora son muy similares a las descritas en bacterias fitopatógenas del suelo. La entrada del patógeno en el sistema radicular se produce a través de heridas, y/o de grietas en el lugar de emergencia de las raíces secundarias. Las células de E. amylovora se multiplican en el apoplasto del córtex de la raíz, alcanzan el sistema vascular y se desplazan a través del xilema a las partes aéreas de la planta, donde son capaces de generar síntomas típicos de fuego bacteriano. En el Capítulo 4 se describen los resultados de un estudio sobre el papel de RpoS en las respuestas de E. amylovora a condiciones de inanición, la protección cruzada frente a distintos tipos de estrés, la movilidad, la producción de EPSs, y la virulencia (Anexo VI; Santander et al., 2014a), que se realizó, en parte, en el Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP, Madrid). Para ello se obtuvo un mutante de E. amylovora en el gen rpoS junto con la correspondiente cepa complementada, que se caracterizaron mediante distintos ensayos junto con la cepa silvestre. Los resultados más importantes de este estudio son: i) El mutante de E. amylovora deficiente en RpoS es más sensible a condiciones de inanición: muestra una inducción más rápida de la respuesta VBNC acompañada de una pérdida de viabilidad y lisis celular no observadas en la cepa silvestre. ii) En E. amylovora el factor sigma RpoS participa en la protección cruzada de células en fase estacionaria frente a estrés osmótico, ácido y oxidativo, y juega un papel esencial en la respuesta a choque térmico. La protección frente a choque ácido, sin embargo, es independiente de RpoS. iii) RpoS aumenta la supervivencia de E. amylovora en tejidos de tabaco (planta no susceptible). La mutación en el gen rpoS genera un aumento de la virulencia de E. amylovora en frutos inmaduros, un aumento significativo de la producción de levano, una ligera disminución en el caso de amilovorano y una reducción de la movilidad por swimming. Por último, en el Capítulo 5 se resumen los resultados correspondientes a un estudio no publicado sobre el papel de las catalasas de E. amylovora KatA y KatG durante las respuestas a condiciones de inanición y las interacciones planta-patógeno (Anexo VII; Santander et al., 2016, no publicado). Para ello, se construyeron mutantes de E. amylovora (dos simples y uno doble) en los genes que codifican las catalasas, y también las correspondientes cepas complementadas. La caracterización del papel funcional de las catalasas se llevó a cabo mediante: estudios de expresión, mediciones in vivo e in vitro de actividad catalasa, la detección de isoenzimas por zimografía después de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, del inglés PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) en condiciones nativas, identificación de proteínas mediante cromatografía líquida-espectroscopía de masas (LC-MS/MS, del inglés Liquid Chromatography – Mass Spectometry), monitorización de las dinámicas poblacionales de células cultivables, viables y totales durante la exposición a condiciones de inanición, ensayos de inhibición de crecimiento, estudios de supervivencia en tejidos de plantas no hospedadoras y ensayos de virulencia. Los resultados más relevantes de este trabajo son: i) Los genes katA y katG de E. amylovora se inducen en las fases de crecimiento estacionario y exponencial, respectivamente. Ambos genes se inducen también en presencia de H2O2 y en los tejidos del hospedador. El análisis de la actividad catalasa reveló que la mayor parte de dicha actividad en E. amylovora corresponde a KatA. KatA y KatG son las únicas fuentes de actividad catalasa en E. amylovora. ii) Es posible detectar KatA, pero no KatG mediante zimografía estándar y LC-MS/MS. iii) KatA, y en segundo lugar KatG, son necesarias para la protección de E. amylovora frente a H2O2 y menadiona. iv) La ausencia de actividad catalasa en el doble mutante (sin KatA ni KatG) de E. amylovora induce un desarrollo más rápido de la respuesta VBNC que en el resto de cepas en condiciones de inanición. Este fenómeno no se observa ni en la cepa silvestre ni en los mutantes simples (sin KatA o KatG), que se comportan de manera equivalente a la cepa silvestre. La adición de catalasa a las placas de medio de cultivo o la complementación de las cepas mutantes con una copia funcional de los genes que codifican las catalasas, mejora la cultivabilidad, pero no evita la entrada en el estado VBNC. v) Las catalasas de E. amylovora juegan un papel importante en la supervivencia de la bacteria en los tejidos de una planta no susceptible. En plantas sensibles al patógeno, KatA y KatG desempeñan diferentes funciones durante el proceso infeccioso. KatG parece más importante en los estadios iniciales de la infección, mientras que KatA parece contribuir a la progresión de E. amylovora en los tejidos del hospedador. Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral se pueden resumir en: 1) Las temperaturas ambientales entre 14ºC y 20ºC favorecen la persistencia en estado cultivable de células de E. amylovora expuestas a condiciones de inanición. Las temperaturas por encima y por debajo de este rango inducen una entrada progresiva en el estado VBNC. Las temperaturas más bajas, además, mejoran el mantenimiento de la viabilidad celular durante la entrada en el estado VBNC. Las adaptaciones de E. amylovora a condiciones de escasez nutricional incluyen cambios morfológicos, reducción de tamaño (dwarfing), modulación de la movilidad y también de la expresión génica. La reducción del tamaño de las células es dependiente de la temperatura de incubación. 2) Las células de E. amylovora en estado de supervivencia en inanición son patógenas. La inducción del estado VBNC por exposición a inanición o cloro conduce a una pérdida de patogenicidad en frutos inmaduros, que puede ser revertida mediante pase a través de plántulas de peral susceptibles. 3) En condiciones controladas de laboratorio, E. amylovora es patógena incluso a 4ºC. Además, muchos factores de virulencia son inducidos a temperaturas inferiores a la óptima de crecimiento. 4) E. amylovora es capaz de sobrevivir en C. capitata durante, al menos, 28 días, y las condiciones en el insecto inducen la entrada del patógeno en el estado VBNC. E. amylovora forma agregados celulares y/o estructuras similares a las biopelículas en la superficie de C. capitata (en la parte distal de las alas, el abdomen y el ovopositor), aunque también puede ser internalizada por el insecto y persistir hasta 8 días en su interior (en el aparato bucal, el buche y el tracto digestivo). 5) La transmisión de E. amylovora por C. capitata ocurre, principalmente, por contacto de la mosca con la superficie de las plantas. Las hembras, además, pueden inocular E. amylovora en el interior de tejidos susceptibles mediante el ovopositor. Por tanto, C. capitata podría ser un vector potencial de E. amylovora. 6) E. amylovora es capaz de invadir plántulas de peral a través de las raíces, que desarrollan síntomas característicos de fuego bacteriano en la parte aérea. El patógeno, además, en condiciones controladas es capaz de infectar plántulas de peral a través de las raíces mediante inoculación por riego, y el porcentaje de infección aumenta en plantas con raíces dañadas por trasplante. Las etapas de infección de la raíz de peral por E. amylovora son muy similares a las de otras bacterias fitopatógenas del suelo. 7) El factor sigma RpoS contribuye al mantenimiento de la cultivabilidad y la viabilidad en células de E. amylovora en condiciones de inanición. También participa en la protección cruzada de células de E. amylovora en fase estacionaria frente a diversos tipos de estrés que el patógeno puede encontrar en la naturaleza, contribuye a la supervivencia de E. amylovora en los tejidos de plantas no hospedadoras, y modula la producción de EPSs, la movilidad y también la virulencia en frutos inmaduros. 8) La expresión de los genes que codifican las catalasas KatA y KatG de E. amylovora es dependiente de la fase de crecimiento, y se induce en presencia de H2O2 y tejidos del hospedador. KatA y KatG también poseen diferente actividad catalasa, lo que indica papeles funcionales diferenciados para cada una de estas catalasas. Ambas contribuyen al mantenimiento de la cultivabilidad en células de E. amylovora expuestas a condiciones de inanición, retrasando, por lo tanto, la entrada en el estado VBNC, además, contribuyen también a la supervivencia del patógeno en tejidos de hospedadores no susceptibles, y son necesarias para una virulencia completa en frutos inmaduros. En resumen, la investigación realizada en esta Tesis Doctoral proporciona nueva información acerca de los mecanismos que permiten a E. amylovora sobrevivir fuera del hospedador. De acuerdo con los resultados aquí expuestos, tanto los estados de supervivencia en inanición como VBNC podrían formar parte del ciclo de vida de E. amylovora, contribuyendo a su persistencia en el ambiente, diseminación y probablemente también al desarrollo de la enfermedad en condiciones de campo. Estos resultados podrían explicar, en parte, la distribución global de E. amylovora por distintos países en diferentes zonas climáticas. Así mismo, dado que el conocimiento del ciclo de vida de los patógenos es imprescindible para establecer medidas de prevención y control de las enfermedades, los datos aportados en esta Tesis podrían contribuir a la mejora de las existentes.