Extracción de proteínas
2021
Martínez Chacón, Guadalupe | Fuentes Rodríguez, José Manuel | Yakhine-Diop, Sokhna M. S. | Rodríguez Arribas, Mario | Paredes Barquero, Marta | Alegre Cortés, Eva | Canales Cortés, Saray | Duque González, Gema | Giménez Bejarano, Alberto | Delgado Luceño, María Pura | Uribe Carretero, Elisabet | Niso Santano, Mireia | González Polo, Rosa Ana | Universidad de Extremadura. Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Genética
El estudio sobre la extracción de proteínas consiste en que, antes de usar, el reactivo A y reactivo B se complementaron con cóctel inhibidor de proteasa 10X (Sigma-Aldrich, P2714), ortovanadato de sodio al 0,5 M al 20 % (S6508, Sigma) y fluoruro de sodio al 0,1 M al 1 % (131675, Panreac). Las mitocondrias aisladas se lisaron en CHAPS al 2 % (C3023, Sigma). Las extracciones citosólicas y mitocondriales se analizaron mediante transferencia Western blotting. El protocolo B debe ser rápido, intentando no sobrepasar 30 segundos. Por otro lado, la adición de 1 μg/ml Leupeptina. 1 μg/ml Pepstatina. 1 μg/ml Aprotinina. 1 μg/ml Benzamidina. El PMSF se diluye en 1 ml de etanol absoluto filtrado. Si hay problemas con el método, probar modificando la concentración de digitonina.
显示更多 [+] 显示较少 [-]The protein extraction study consists of reagent A and reagent B supplemented with 10X protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, P2714), 0,5 M 20 % sodium orthovanadate (S6508, Sigma) and 0,1 M 1 % sodium fluoride (131675, Panreac) before use. Isolated mitochondria were lysed in 2 % CHAPS (C3023, Sigma). Cytosolic and mitochondrial extractions were analysed by Western blotting. Protocol B should be fast, trying not to exceed 30 seconds. On the other hand, the addition of 1 μg/ml Leupeptin. 1 μg/ml Pepstatin. 1 μg/ml Aprotinin. 1 μg/ml Benzamidine. PMSF is diluted in 1 ml of filtered absolute ethanol. If there are problems with the method, try modifying the digitonin concentration.
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