VPg-eIF(iso)4E interaction, coat protein production and virion formation in potato virus A infection

Potato Virus A (PVA), which belongs to the family Potyviridae, is a significant agricultural plant virus that causes crop loss worldwide. Most potyvirus resistance is recessive and occurs due to the loss of interaction between the viral protein genome linked (VPg) and the host eukaryotic initiation factor [eIF4E/(iso)4E]. This interaction has been demonstrated in many cultivated plants that are susceptible to potyviruses. Studies on potyvirus resistance have shown that minute changes in either eIF4E/(iso)4E or VPg can cause the interaction to fail, resulting in the development of viral resistance. However, the detailed mechanisms underlying the significant effects of this interaction during potyvirus infection remain unclear. The central domain of the PVA VPg contains an eIF(iso)4E-binding consensus motif, Tyr-X-X-X-X-Leu-phi (YXXXLΦ). The function of this motif during the VPg–eIF(iso)4E interaction, in the context of PVA infection, was investigated in the present study. The tyrosine and the leucine residues at the binding site were replaced with alanine residues in PVA infectious cDNA (icDNA, PVAVPgmut) and in a VPg expression construct (VPgmut). The results showed that PVAVPgmut was capable of replicating inside the host cell, but overall gene expression remained low, similar to the levels observed for a replication-deficient virus. Systemic infection in PVAVPgmut-infected plants only occurred upon reversion to the wild-type PVA, which occurred in 26% of PVAVPgmut-infected plants by 15 days postinfection. Although VPg typically stabilises viral RNA (vRNA) and 3’ renilla luciferase (RLUC) expression, as published previously, the VPgmut failed to perform these functions. The helper component proteinase (HCPro) induces the generation of PVA-induced granules (PGs) during infection and the assembly of vRNA within these PGs to safeguard vRNA from being silenced. Plants infected with PVAVPgmut showed an increased number of PG-like foci in infected cells as compared to the plants infected with PVAWT. However, in compare to the PVAWT the percentage of PVA RNA colocalising with PGs was significantly low in PVAVPgmut infected leaf samples. The host eIF(iso)4E is thought to bind to the PVA VPg via the YXXXLΦ motif, and this interaction is considered to be essential for PVA RNA stabilisation, the transfer of RNA to the RNA silencing suppression pathway, and RNA translocation to polysomes for viral protein synthesis. In the second study, an alternative mechanism was explored involving the production of large quantities of coat protein (CP), which is a multi-functional protein. Tight control over CP production is necessary, depending on the stage of virus infection. Increased CP concentrations have been shown to represses potyviral gene expression. Therefore, CP concentrations are maintained at low levels during active gene expression in the early infection stage through a host-mediated degradation system. During later infection stages, CP is required at high quantities for the production of a large number of stable particles. The present study showed that ectopically expressed VPg enhances reporter expression more pronouncedly from the 3' side of the genome than from the 5’ side. A similar phenomenon was observed towards the later stages of the infection, in which the 3’ CP cistron and the 3’ reporter cistron were expressed more pronouncedly than the central cylindrical inclusion (CI) cistron and the 5’ reporter cistron. The 3’CP and 3’ reporter protein showed different production/accumulation dynamics than were observed for the rest of the genome. CP expression levels were observed to increase in the presence of overexpressed VPg, during both the early infection stage and towards the later infection stage. This process could represent the mechanism through which potyviruses increase CP production for sufficient virion formation. In the third study of this thesis, whether the stabilisation of CP was necessary for successful virion formation was investigated. These results revealed the function of PVA HCPro during CP stabilisation and virion formation. HCPro was found to be unable to stabilise CP in a virus-free system. A number of additional host and viral factors are necessary to produce stable particles. CP stability by HCPro is unrelated to its capacity for silencing suppression and, therefore, cannot be complemented by other viral silencing suppressors. Together, the findings described in this dissertation revealed important mechanisms that underlie potyvirus recessive resistance and the factors that affect stable virion formation.

Potyvirdae heimoon kuuluva perunan A virus (PVA) on merkittävä kasvivirus, koska se aiheuttaa maataloudelle satotappioita maailmanlaajuisesti. Suurimmaksi osaksi tunnettu kestävyys potyviruksia vastaan on resessiivistä ja johtuu siitä, että viruksen genomiin linkittyvän VPg-proteiinin ja isäntäkasvin eukaryoottisen initiaatiofaktori eIF4E/(iso)4E:n välillä esiintyvä vuorovaikutus on estynyt. Kyseinen vuorovaikutus on osoitettu useissa potyviruksella infektoituneessa viljelykasvissa. Potyviruskestävyyttä tutkittaessa on todettu, että hyvin pienetkin muutokset eIF4E/(iso)4E:ssä ja VPg:ssä voivat johtaa infektion epäonnistumiseen ja viruskestävyyden kehittymiseen. Se, mistä tämän vuorovaikutuksen merkittävät vaikutukset täsmällisesti johtuvat molekulaarisen mekanismin tasolla on jäänyt epäselväksi. PVA:n VPg:n aminohapposekvenssin keskellä on eIF(iso)4E:tä sitova konsensusmotiivi, Tyr-X-X-X-X-Leu-phi (YXXXLΦ). Tässä tutkimuksessa selvitettiin VPg–eIF(iso)4E vuorovaikutuksen tehtävää PVA infektiossa. Sitoutumisen konsensusmotiivin tyrosiinin ja leusiinin kodonit vaihdettiin alaniinin kodoneiksi PVA:n infektiivisessä cDNA:ssa (PVAVPgmut) ja VPg:n ekspressiokonstruktissa (VPgmut). Tulokset osoittivat, että PVAVPgmut pystyi replikoitumaan isäntäsolussa, mutta geeniekspressiotaso pysyi matalana, samalla tasolla kuin replikaatiokyvyttömällä PVA mutanttiviruksella. PVAVPgmut mutanttivirus aiheutti systeemisen infektion kasvissa vain silloin, jos se muuntui takaisin villityyppiseksi PVA:ksi. Tämä tapahtui 26%:ssa kasveista 15 päivän sisällä infektioista. Vaikka VPg tyypillisesti stabiloi PVA RNA:ta ja vahvistaa virusgenomin 3’päästä tuotetun Renilla lusiferaasireportterin ilmentymistä, kuten aiemmin on julkaistu, VPgmut ei tähän kyennyt. Viruksen HCPro proteiini aloittaa PVA infektion indusoimien granuloiden (PG) muodostuksen ja virus RNA:n (vRNA) assosioituminen näihin rakenteisiin suojaa sitä geenihiljennykseltä. PVAVPgmut mutanttiviruksella infektoiduissa soluissa PG:n kaltaiset rakenteet lisääntyivät villityyppisellä PVA:lla infektoituihin soluihin verrattuna. Kuitenkin vRNA:n assosioituminen PVAVPgmut infektiossa esiintyviin rakenteisiin oli merkittävästi vähäisempää kuin normaalin infektion aikana. Näyttää siis siltä, että isännän eIF(iso)4E sitoutuu PVA VPg: hen YXXXLΦ-motiivin kautta ja että tämä vuorovaikutus on välttämätön PVA RNA: n stabiloimiseksi, siirtämiseksi RNA hiljennyksen ulottumattomiin ja viemiseksi polysomeille virusproteiinisynteesiä varten. Seuraavassa osajulkaisussa tutkittiin PVA infektioissa useisiin tehtäviin osallistuvan kuoriproteiinin (CP:n) laajamittaiseen kertymiseen vaikuttavia mekanismeja. CP määrän kontrollointi infektiovaiheen vaatimalla tavalla on välttämätöntä. Tiedetään, että korkeat CP määrät tukahduttavat potyviruksen geeniekspression. Siksi isäntäkasvin hajoitussysteemi pitää CP konsentraation matalana viruksen aktiivisen geeniekspression aikana infektion alussa. Myöhemmin infektion edettyä, CP:a tarvitaan suuria määriä viruspartikkeleiden runsaaseen tuottoon. Tutkimuksessa näytettiin, että VPg:n ylimäärä edistää reportteriproteiinin ilmentymistä huomattavasti enemmän silloin, kun se tuotetaan virusgenomin 3’ pään puolelta kuin 5’ puolelta. Samankaltainen ilmiö havaittiin infektion loppua kohden, kun CP:tä ja reportteriproteiinia tuotettiin 3’pään kistroneista voimakkaammin, kuin CI-proteiinia genomin keskellä olevasta kistronista tai reportteriproteiinia genomin 5’ puolella olevasta kistronista. Genomin 3’ puolelta CP:n ja reportteriproteiinin tuoton tai akkumulaation dynamiikka oli siis erilaista kuin muista osista PVA genomia. VPg:n ylimäärä saa aikaan CP:n ilmentymistason kasvua sekä infektion alussa, että lopussa. Siksi on mahdollista, että sen prosessin, jonka avulla partikkeleiden muodostukseen tarvittava CP:n määrä saavutetaan, mekanismi liittyy VPg:n määrän säätelyyn. Tämän väitöskirjan kolmannessa osatyössä tutkittiin, tarvitaanko CP:n stabilsoitumista onnistuneeseen partikkelin tuottoon. Työn tulokset paljastivat, että PVA:n HCPro osallistuu CP:n stabilomiseen ja virionin muodostukseen. HCPro ei kuitenkaan pystynyt stabiloimaan CP:tä itsenäisesti ilman virusinfektiota. Lisäksi, stabiilien partikkeleiden muodostus vaatii monia muitakin isäntäkasvin ja viruksen tekijöitä. HCPro:n stabilioiva vaikutus CP:in ei liity HCPro:n geenihiljennyksen tukahduttajana toimimiseen. Siksi stabilointitehtävää ei voitu komplementoida muiden virusten geenihiljennyksen tukahduttajaproteiinien avulla. Yhteenvetona, tässä väitöskirjassa kuvatut molekulaariset mekanismit toimivat joko potyvirusten resessiivisen resistenssin taustalla tai vaikuttavat normaaliin stabiilien viruspartikkeleiden muodostumiseen.