Cereulide producing B. cereus and amylosin producing B. subtilis and B. mojavensis : characterization of strains and toxigenicities

B. cereus is one of the most frequent occurring bacteria in foods . It produces several heat-labile enterotoxins and one stable non-protein toxin, cereulide (emetic), which may be pre-formed in food. Cereulide is a heat stable peptide whose structure and mechanism of action were in the past decade elucidated. Until this work, the detection of cereulide was done by biological assays. With my mentors, I developed the first quantitative chemical assay for cereulide. The assay is based on liquid chromatography (HPLC) combined with ion trap mass spectrometry and the calibration is done with valinomycin and purified cereulide. To detect and quantitate valinomycin and cereulide, their [NH4+] adducts, m/z 1128.9 and m/z 1171 respectively, were used. This was a breakthrough in the cereulide research and became a very powerful tool of investigation. This tool made it possible to prove for the first time that the toxin produced by B. cereus in heat-treated food caused human illness. Until this thesis work (Paper II), cereulide producing B. cereus strains were believed to represent a homogenous group of clonal strains. The cereulide producing strains investigated in those studies originated mostly from food poisoning incidents. We used strains of many origins and analyzed them using a polyphasic approach. We found that the cereulide producing B. cereus strains are genetically and biologically more diverse than assumed in earlier studies. The strains diverge in the adenylate kinase (adk) gene (two sequence types), in ribopatterns obtained with EcoRI and PvuII (three patterns), tyrosin decomposition, haemolysis and lecithine hydrolysis (two phenotypes). Our study was the first demonstration of diversity within the cereulide producing strains of B. cereus. To manage the risk for cereulide production in food, understanding is needed on factors that may upregulate cereulide production in a given food matrix and the environmental factors affecting it. As a contribution towards this direction, we adjusted the growth environment and measured the cereulide production by strains selected for diversity. The temperature range where cereulide is produced was narrower than that for growth for most of the producer strains. Most cereulide was by most strains produced at room temperature (20 - 23ºC). Exceptions to this were two faecal isolates which produced the same amount of cereulide from 23 ºC up until 39ºC. We also found that at 37º C the choice of growth media for cereulide production differed from that at the room temperature. The food composition and temperature may thus be a key for understanding cereulide production in foods as well as in the gut. We investigated the contents of [K+], [Na+] and amino acids of six growth media. Statistical evaluation indicated a significant positive correlation between the ratio [K+]:[Na+] and the production of cereulide, but only when the concentrations of glycine and [Na+] were constant. Of the amino acids only glycine correlated positively with high cereulide production. Glycine is used worldwide as food additive (E 640), flavor modifier, humectant, acidity regulator, and is permitted in the European Union countries, with no regulatory quantitative limitation, in most types of foods. B. subtilis group members are endospore-forming bacteria ubiquitous in the environment, similar to B. cereus in this respect. Bacillus species other than B. cereus have only sporadically been identified as causative agents of food-borne illnesses. We found (Paper IV) that food-borne isolates of B. subtilis and B. mojavensis produced amylosin. It is possible that amylosin was the agent responsible for the food-borne illness, since no other toxic substance was found in the strains. This is the first report on amylosin production by strains isolated from food. We found that the temperature requirement for amylosin production was higher for the B. subtilis strain F 2564/96, a mesophilic producer, than for B. mojavensis strains eela 2293 and B 31, psychrotolerant producers. We also found that an atmosphere with low oxygen did not prevent the production of amylosin. Ready-to-eat foods packaged in micro-aerophilic atmosphere and/or stored at temperatures above 10 °C, may thus pose a risk when toxigenic strains of B. subtilis or B. mojavensis are present.

Bacillus cereus on elintarvikkeiden yleisimpiä bakteereja. Se tuottaa useita erilaisia enterotoksiineja, joista yksi on kuumennusta kestävä peptidi (oksetus- eli emeettinen toksiini, kereulidi), muut toksiinit kuumennusherkkiä. Oksetustoksiinin määritys elintarvikkeissa perustui myrkkyvaikutusten toteamiseen, kunnes viime vuosikymmenen kuluessa tämän toksiinin rakenne selvitettiin. Ensimmäinen, toksiinin rakenteeseen perustuva kereulidin kvantitointimenetelmä on minun kehittämäni, yhdessä opettajieni kanssa. Menetelmä perustuu korkean erotuskyvyn nestekromatografiaan (HPLC) yhdistettynä joniloukku massaspektrometriaan. Kalibrointiin käytin valinomysiiniä (kereulidin sukulaismyrkky) ja tuottajabakteerista eristettyä kereulidia. Kvantitointi perustuu kummankin yhdisteen [NH4+] - adduktien massajoneihin, jotka ovat edelliselle m/z 1128.9 ja jälkimmäiselle m/z 1171. Tämä luotettava työmenetelmä mahdollisti läpimurron kansainvälisessä kereuliditutkimuksessa. Sen avulla voitiin ensimmäistä kertaa osoittaa että B. cereus'ksen tuottama toksiini, eikä välttämättä itse bakteeri, oli syyllinen elintarvikkeen aiheuttamaan ruokamyrkytykseen. Ennen väitöstutkimustani uskottiin yleisesti, että kereulidia tuottavat B. cereus kannat ovat toistensa klooneja, eli homogeeninen ryhmä samankaltaisin ominaisuuksin. Tämä käsitys perustui siihen, että oli tutkittu vain ruokamyrkytystapauksista löydettyjä bakteerikantoja. Tutkin työssäni kereulidia tuottavia kantoja monista eri lähteistä ja vertasin niitä toisiinsa polyfaasisilla menetelmillä, eli yhdistämällä biokemian, fysiologian ja genetiikan keinoja. Tulokset osoittivat että kereulidin tuottajat eroavat toisistaan sekä perintötekijöiltään että biologisilta ominaisuuksiltaan. Kereulidin tuottajilta löytyi kaksi erilaista adenylaattikinaasin geeniä (adk). Niiden ribosomaalista RNAta tuottavat geenit olivat sijoittuneet erilaisiin geeniympäristöihin eri kannoissa, mikä näkyi kolmena erilaisena ribopattern'ina, kun genomia pilkottiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja PvuII. Eri kannat poikkesivat toisistaan myös kyvyissään hajottaa tyrosiinia, veren punasoluja (hemolyysi) ja lesitiiniä (kaksi biotyyppiä kussakin). Tutkimukseni oli ensimmäinen osoitus heterogeenisyydestä kereulidia tuottavien B. cereus bakteerien ryhmässä. Jotta kereulidimyrkyn muodostumisen riskejä pystyttäisiin arvioimaan ja hallitsemaan, on välttämätöntä tuntea ne tekijät, jotka lisäävät tai vähentävät sen tuottoa elintarvikkeessa. Valitsin tähän tutkimukseeni useita ominaisuuksiltaan erilaisia kereulidin tuottajakantoja, ja tutkin niiden toksiinituottoa erilaisissa vakioympäristöissä. Tulokset osoittivat, että ympäristön lämpötila rajoitti tiukemmin kereulidin tuottoa kuin tuottajakantojen kasvua. Useimmat kannat tuottivat kereulidia eniten kun lämpötila oli 20 - 23ºC. Sensijaan ihmisen ulosteista eristettyjen kantojen toksiinintuottotahti oli vakio lämpötila-alueella 23 ºC - 39ºC. Havaitsimme myös, että 37º C lämmössä tuotetun kereulidin määrä riippui joillakin mutta ei kaikilla kannoilla ravinnnon laadusta, vaikka ravinnosta riippuvuutta ei havaittu kun samoja kantoja tutkittiin huoneenlämmössä. Kereulidin tuoton riippuvuus ympäristön ravinteista ja lämpötilasta lienee ratkaisevaa sille, tuottaako kyseinen kanta kereulidia jossakin tietyssä ruuassa tai, kun ruoka on syöty, suolistossa. Valitsimme lähempään tutkimukseen kuusi kasvualustaa, jotka suosivat tai hidastivat kereulidin tuottoa. Koostumusanalyysien tilastollinen tarkastelu paljasti merkitsevän positiivisen korrelaation kereulidin tuoton ja kasvualustan [K+]:[Na+] suhteen välillä, mutta vain jos eräät toiset muuttujat, glysiinin ja natriumin ([Na+]) pitoisuudet vakioitiin. Aminohapoista vain glysiinin pitoisuus edisti korkeaa kereulidin tuottoa. Glysiini on elintarvikelisäaine (E 640), käyttö hyväksytty Euroopan Unionissa elintarvikkeiden aromivahventeena, kosteuden ja happamuuden tasaajana. Sen käytölle ole säädetty määrällisiä rajoituksia. Bacillus subtilis ryhmä kuuluu lämpökestoisia itiöitä tuottaviin ympäristöbakteereihin kuten B. cereus. Eri Bacillus lajeja on kirjallisuudessa silloin tällöin epäilty ruokamyrkytysten aiheuttajiksi. Väitöstyössäni tutkin ruokamyrkytyksiä aiheuttaneiksi epäillyistä elintarvikkeista eristettyjä B. subtilis ja B. mojavensis kantoja. Tunnistin osan niistä toksiinin tuottajiksi. On mahdollista, että sairastumisen aiheutti amylosiini, koska amylosiinin tuottajien lisäksi ei löytynyt muita toksiinin tuottajia. Nämä tutkimustulokset olivat ensimmäinen kerta kun amylosiinia tuottavia bakteereja löydettiin ruuasta. Lämpötilavasteita tutkiessani havaitsin, että amylosiinin tuotto mesofiilisellä kannalla B. subtilis F 2564/96 edellytti korkeampaa lämpötilaa kuin psykrofiileillä B. mojavensis kannoilla eela 2293 and B 31. Havaitsin myös, että näiden bakteerien amylosiinin tuotto ei edellyttänyt hapen läsnäoloa. Muunnettuun ilmakehään pakatuissa valmisruuissa amylosiinin muodostus voi olla mahdollista, jos niissä on toksigeenisiä B. subtilis tai B. mojavensis kantoja ja jos lämpötila ylittää 10◦C.