Cyanobacterial specialized metabolites : biosynthesis, bioactivity and structure

Cyanobacteria produce a variety of toxins and a diversity of other specialized metabolites. Specialized metabolites are compounds produced by an organism to interact with the environment and provide protection against competitors, predators, or abiotic factors. The biosynthetic pathways for generating specialized metabolites are typically encoded in compact gene clusters that encode multiple biosynthetic enzymes. The structure and biosynthesis of all major cyanobacterial toxins have been resolved, but new compounds with variable functions are continuously discovered and their biosynthetic origins elucidated. Cyanobacterial specialized metabolites are widely held to have great potential in the pharmaceutical industry given the increasing need for new drugs that target infectious disease and cancer. A better understanding of the chemical structure of the compounds facilitates discovery of their biological targets and their ecological role. The aim of this study was to discover new potential drug leads from cyanobacteria, focusing on antifungal compounds, and describe their structure, activity, and biosynthetic origins. Laxaphycins are unusual specialized metabolites that consist of two distinct macrocyclic lipopeptides with either 11 or 12 amino acids. They are known to have synergistic antiproliferative and antifungal activities but unknown biosynthetic origins. Here, new chemical variants of laxaphycin family specialized metabolites were discovered from Nostoc sp. UHCC 0702 and Scytonema hofmannii PCC 7110. The laxaphycin biosynthetic gene cluster was discovered, organized as a branching pathway, with initiating enzymes participating in the biosynthesis of both different lipopeptide groups. The biosynthetic gene cluster was described in both Scytonema hofmannii PCC 7110 and Nostoc sp. UHCC 0702. New laxaphycin variants heinamides were discovered with unforeseen structural moieties and I present predictions for their origins. I confirmed that heinamides also displayed synergistic antifungal activity. The connection of the 11- and 12- amino acid residue compounds is also evident at the genetic level with the common biosynthetic enzymes of the synergistic compounds. Aeruginosins are common cyanobacterial tetrapeptides with inhibitory activity against serine proteases. Trypsin isoforms have recently been studied as a target in cancer treatment. Here pseudospumigins, new aeruginosin variants, were discovered from Nostoc sp. CENA 543. Pseudospumigins are produced through a PKS/NRPS pathway similar to known aeruginosin biosynthetic gene clusters. Pseudospumigin A acts as weak trypsin inhibitor, with time dependent IC50 value of 4.5 ȝM. Nodularin-R, a cyanotoxin, was also found from the same strain. The nodularin concentration was much higher than what has been seen in a Nostoc strain before, comparable to nodularin concentrations in the most common nodularin producers Nodularia spumigena. This study describes new cyanobacterial specialized metabolites and biosynthetic enzymes for their biosynthesis, broadening the knowledge in areas of novel structural elements, biosynthetic pathways and biological activity. The structural and activity information can help in function prediction and rational design of drug candidates or guide the screening for specific targets. The genetic information can be used in mining genomes for discovering new compounds and predicting products for cryptic biosynthetic gene clusters. Probable applications lie also in the emerging fields of combinatory biosynthesis and synthetic biology to produce engineered compounds in biological systems.

Syanobakteerit, eli sinilevät, tuottavat monenlaisia myrkkyjä ja muita biologisesti aktiivisia luonnonyhdisteitä. Luonnonyhdisteitä tuottavat organismit pyrkivät niiden avulla vuorovaikutukseen ympäristönsä kanssa esimerkiksi suojautuakseen saalistajilta, kilpailijoilta tai elottomilta tekijöiltä kuten säteilyltä. Näiden yhdisteiden tuottamiseen tarvittava geneettinen informaatio on tavallisesti koodattu biosynteettisiin geeniryppäisiin, jotka tuottavat useita entsyymejä yhdisteen kokoamiseksi. Yleisimpien syanobakteerien tuottamien myrkkyjen ja yhdisteiden rakenteet ja biosynteesireitit on selvitetty, mutta uusia yhdisteitä ja niiden geneettistä alkuperää kuvataan jatkuvasti. Syanobakteerien tuottamissa luonnonyhdisteissä nähdään potentiaalia lääketeollisuudessa. Erilaisten tartuntatautien ja syöpien hoitotarpeen kasvaessa ja mikrobilääkeresistenssin yleistyessä etsitään uusia lääkkeitä. Syanobakteerien tuottamien yhdisteiden monimuotoisuudessa nähdään potentiaalia lääkekehityksessä tarvittavien johtolankamolekyylien löytämiseen. Tämän tutkimuksen päämääränä oli löytää syanobakteereista uusia johtolankamolekyylejä ja kuvata näiden rakenne, biologinen aktiivisuus ja biosynteettinen alkuperä. Löysin uusia laksafysiini-perheen yhdisteitä bakteereista Nostoc sp. UHCC 0702 ja Scytonema hofmannii PCC 7110. Laksafysiinit ovat joukko syanobakteerien tuottamia luonnonyhdisteitä, joilla on sienten ja syöpäsolulinjojen kasvua estäviä ominaisuuksia. Laksafysiinit ovat makrosyklisiä lipopeptidejä, jotka jaetaan kahteen rakenteellisesti eroavaan ryhmään, 11- ja 12-aminohapon ryhmiin. Näiden ryhmien välillä on vahva synergistinen muiden organismien kasvua estävä vaikutus. Tässä tutkimuksessa laksafysiinien biosynteesireitti kuvataan ensimmäistä kertaa. Laksafysiinien tuotanto tapahtuu haarautuvalla biosynteesireitillä, jossa biosynteesin käynnistävät entsyymit osallistuvat molempien yhdisteryhmien tuotantoon. Biosynteettinen geenirypäs kuvattiin molemmista tutkituista laksafysiinejä tuottaneista bakteerikannoista. Uusi ryhmä laksafysiinien rakenteellisia variantteja löydettiin: heinamidit. Heinamideilla on ennennäkemättömiä rakenteellisia ominaisuuksia, joiden alkuperälle esitän ennusteet. Uudet variantit estävät sienten kasvua synergisesti, kuten aiemmin kuvatut laksafysiinit. 11-ja 12-aminohappotähteen yhdisteiden yhteisvaikutus linkittyy mielenkiintoisesti perimätasolla, kun yhdisteet jakavat osan biosynteesireiteistään. Aeruginosiinit ovat yleisiä syanobakteerien tuottamia tetrapeptidejä, joilla on trypsiinin kaltaisia entsyymejä inhiboiva vaikutus. Trypsiiniä on viime aikoina tutkittu mahdollisena lääkeaineiden kohteena syöpähoidoissa. Tässä työssä löysimme uusia aeruginosiinien rakenteellisia variantteja, jotka nimesimme pseudospumigiineiksi. Pseudospumigiinit löydettiin bakteerikannasta Nostoc sp. CENA 543. Pseudospumigiinit tuotetaan bakteerisolussa PKS/NRPS biosynteesireittiä pitkin, joka muistuttaa aeruginosiinien biosynteesiä. Pseudospumigiini A toimii trypsiini-inhibiittorina, jonka aikariippuvainen IC50 arvo on 4,5 μM. Myös Nodulariini-R maksamyrkkyä löydettiin samasta bakteerikannasta. Kannan nodulariinipitoisuus oli paljon suurempi, kuin Nostoc suvun bakteereista on aiemmin löydetty ja verrattavissa yleisimpien nodulariinituottajien, Nodularia spumigena -lajin bakteerien, tuottamiin pitoisuuksiin. Tämä väitöskirja kuvaa uusia syanobakteerien tuottamia luonnonyhdisteitä, niiden biologista aktiivisuutta ja niiden biosynteesireitit, laajentaen ymmärtämystämme luonnonyhdisteiden mahdollisuuksista. Tieto yhdisteiden uusista kemiallisista rakenteista ja niiden bioaktiivisuudesta voi auttaa lääkeyhdisteiden rationaalista suunnittelua tai ohjata johtolankamolekyylien seulontaa tarkempiin kohteisiin. Tiedon avulla voimme myös tehdä parempia tulkintoja siitä, mitä hyötyä yhdisteistä on niitä tuottaville bakteereille. Geneettistä tietoa voidaan käyttää geenilouhintaan uusia yhdisteitä etsittäessä ja tuntemattomien biosynteettisten geeniryppäiden tuotteiden ennustamiseen. Todennäköisesti tietoa tullaan myös käyttämään synteettisen biologian ja kombinatoriaalisen biosynteesin kasvavilla aloilla suunniteltujen yhdisteiden tuottamiseen muunnelluissa organismeissa.