Proteomic Tools for Food and Feed Authentication

På grunn av globalt økende etterspørsel etter mat og fôr, introduseres nye proteinholdige ingredienser i matsystemene våre i økende skala. Innføring av nye ingredienser og introduksjon av sirkulære matsystemer gir nye utfordringer når det gjelder metoder for avsløring av henholdsvis fôr- og matsvindel. I denne sammenhengen er det viktig å utvikle raske, sensitive og robuste molekylære metoder som kan implementeres i kontroll og overvåkningsøyemed. Tidligere har fremskritt ved bruk av slike verktøy blitt hemmet av en generell mangel på annoterte referansegenomer for målarter som ofte brukes, eller nylig er introdusert, i fôr eller matpreparater. Fokuset for denne doktorgraden er å utvikle og implementere massespektrometriske metoder (LC-MS/MS) som er i stand til å identifisere, differensiere og kvantifisere proteinholdige ingredienser av animalsk og planteopprinnelse i ulike mat- og fôrblandinger ved bruk av massespektra fingeravtrykk. Arbeidet som presenteres i denne doktorgraden omfatter «bottom-up» proteomiske arbeidsflyter ved bruk av høytrykksvæskekromatografi (HPLC) tandem massespektrometri (MS/MS). Databehandling ble utført ved å bruke direkte spektrasammenligning (compareMS2) og spektrabibliotekmatching (SLM) analyser ved bruk av verktøy fra Trans-Proteomics Pipeline (TPP) og annen åpen kildekode til bioinformatisk programvare. Alle data generert og publisert i løpet av denne doktorgraden har blitt gjort tilgjengelig på offentlige repositrium for MS-data, for eksempel Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE), som følger FAIR-prinsippene. Den SLM baserte arbeidsflyten brukt i denne doktorgraden klarte å differensiere ulike prosesserte animalske proteiner (PAP) som storfemelk og bovint blod. SLM ble også brukt til å differensiere ulike insektarter og for å detektere om larver av svart soldatflue (BSF) var fôret med PAP. SLM-metoden ble også brukt til å identifisere og kvantifisere innholdet i et blandingsprodukt av 3 ulike fiskearter. Det ble også funnet at SLM basert proteomikk kan brukes til å identifisere vanlige allergener i insektsprøver tiltenkt humant konsum. Denne tilnærmingen ble også implementert med suksess for å differensiere mellom soyabønneprøver som var enten dyrket organisk, konvensjonelt eller inneholdt genetiske modifikasjoner (GM). I tillegg ble differensiell proteinekspresjon påvist mellom prøver av GM, konvensjonelt og økologisk dyrkede soyabønner. Dette førte til identifisering av to nye peptidmarkører for effektiv sporing av GM-avlinger i mat og fôr. Denne doktorgraden har vist at den SLM baserte metoden er i stand til å identifisere både art og vevstype brukt i et proteinholdig matprodukt eller fôringredients det være seg PAP, plante-, pattedyr- eller fiskeproteiner. Fremtidig arbeid bør fokusere på differensiering og avsløring av svindel i sjømat, som nylig ble fremhevet som et fremvoksende tema i det globale matmarkedet. Alle arts- og vevsspesifikke MS-data samlet inn i det ovennevnte arbeidet vil gjøres tilgjengelig fra i dedikert nettbaserte tjenester. Sistnevnte utvikles for tiden internt, og etter skikkelig kvalitetstesting er det tenkt å bli utgitt offentlig for å gi forskningsmiljøer og myndigheter en lett tilgjengelig plattform for autentisering og identifisering av proteinholdige ingredienser i fôr- og mat.

Due to globally rising demands for food and feed, novel proteinaceous ingredients are introduced into our food systems on an increasing scale. The introduction of novel ingredients and circularity of the food system gives rise to novel challenges concerning the detection of feed and food fraud and the determination of feed and food authenticity, respectively. In this context, developing and increasing the implementation of rapid, sensitive, and robust molecular methods are essential. In the past, progress in applying such tools has been hampered by a general lack of wellannotated reference genomes of target species commonly used or newly introduced in feed or food preparations. This PhD focused on developing and implementing mass spectrometry-based approaches to identify, differentiate, and quantify proteinaceous ingredients of animal and plant origin in various food and feed mixes without using any genomic information. The work presented in this PhD implemented bottom-up proteomic workflows using high-performance liquid chromatography (HPLC) tandem mass spectrometry (MS/MS). Data analyses were done using direct spectra comparison (compareMS2), spectra library matching (SLM), Trans-Proteomics Pipeline (TPP), and MaxQuant software. All data generated and published during this PhD have been made available on public repositories for proteomics data, such as the Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE), following Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable (FAIR) principles. The untargeted proteomics SLM workflow implemented during this PhD successfully differentiated processed animal proteins such as bovine milk and bovine blood. The SLM was also used to identify and authenticate food and feed-grade insect species and to detect if black soldier fly (BSF) larvae were fed on the prohibited PAP. Using the SLM workflow, it was also possible to quantify and authenticate the different species in fish mixtures containing muscle tissues from three different fish species. It was also shown that untargeted proteomics could be used to identify common allergens in foodgrade insect samples. Also, the proteomic approach was successfully implemented to separate thirty-one ready-to-market soybean samples farmed organically, conventionally, and with genetic modifications (GM). Differential protein expression was detected between GM, conventionally, and organically farmed soybean samples. Additional bioinformatics analyses led to the detection of two novel peptide markers for the efficient tracing of GM crops in food and feed. The proteomic tools implemented during this PhD were capable of species and tissues specific identification of proteinaceous food and feed ingredients, including processed animal proteins, plant, mammalian, and fish proteins. Future work should focus on the differentiation and detection of fraud in food and feed in the global food market. Webbased interphase will be developed for food and feed authentication using spectra libraries created during this PhD. Following proper quality testing, the web-based interphase will be released publicly to provide research and regulatory laboratories with an easily accessible platform for authenticating and identifying protein ingredients in feed and food samples.

Doktorgradsavhandling