The role of metal induced protein phosphorylation in neuropathology related protein aggregation | O papel da fosforilação de proteínas induzida por metais em neuropatologias relacionadas com agregação de proteínas

Metal ions play essential roles in the brain, and anomalous levels can contribute to neuronal dysfunction across different neurodegenerative diseases, such as Alzheimer´s Disease (AD). Senile Plaques (SPs) and Neurofibrillary Tangles (NFTs) are histological AD hallmarks, resulting from extracellular Aβ1-42 deposition and intracellular tau phosphorylation, respectively. In AD, Protein Phosphatase 1 (PP1) and PP2A activity is reduced contributing to tau hyperphosphorylation and Aβ aggregation. Moreover, phosphatase activities are diminished upon exposure to different metals. Protein Phosphatases (PPs) are involved in dephosphorylation of several proteins associated with different biological processes. PPs activity can be regulated by several Phosphatase Interacting Proteins (PIPs), which in turn can be regulated by metals, conferring to PPs target specificity. These PIPs can be promising therapeutic targets to modulate the activity of PPs, limiting toxic effects. However, the effects of metals on protein phosphorylation events and their impact on protein aggregation and AD pathology has not been well elucidated. Thus, the work presented in this thesis aims to evaluate the effect of metals on phosphorylation and protein aggregation events, to assess their impact on AD phenotype and to identify potential metal-PIPs-PPs complexes that could be considered as future therapeutic targets for protein aggregation related diseases. Protein aggregation was evaluated in neuroblastoma cell line SH-SY5Y by flow cytometry and microscopy after exposure to Zinc (Zn2+), Copper (Cu2+), Aluminium (Al3+) and Iron (Fe3+) metal cations. The results showed a distinct effect between di and trivalent metals. While divalent cations decrease protein aggregates formation, trivalent metals did not alter aggregation levels. Additionally, we also demonstrated that the aggregates formed by metal exposure are morphologically different from aggregates induced when SH-SY5Y cells are exposed to aggregated Aβ peptide. In more detail, Aβ peptide induced larger protein aggregates formation, contrastingly with the small protein aggregates visualized after metal exposure. To address the effect of metals directly on Aβ peptide aggregation, Zn2+, Cu2+, Al3+ and Fe3+ were co-incubated in situ with Aβ1-42. It was observed that the divalent cations decreased amyloid fibrils and oligomers formation. In contrast, the trivalent cations induced a slight increase in Aβ oligomers formation, the most toxic form of the peptide. Subsequently, the impact of metals at molecular level was also evaluated. It was observed that Al3+ and Fe3+ induce Amyloid-β Precursor Protein (APP) phosphorylation and β-cleavage as well as tau phosphorylation, both events associated with AD. In contrast, the divalent cations decreased tau phosphorylation, possibly by modulating N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity, preventing the activation of excitotoxic pathways. Throughout this work, it was found that the distinct impact of metals in the activity/expression of PPs might be responsible for the altered phosphorylation states of AD related proteins described above. However, given the wide range of signalling pathways that are regulated by PPs, direct regulation of their activity could have undesired molecular consequences. Thus, a bioinformatics analysis was performed to identify the metal binding PIPs that are involved in different protein aggregation related diseases, namely AD. With this approach, 27 metal binding PIPs were identified. Through their modulation, these metal-PIPs-PPs complexes could represent future therapeutic targets for several protein aggregation related diseases. The effect of using zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) as a Zn transport mechanism in neuronal cells was also evaluated, and it was concluded that these have a beneficial effect counteracting protein aggregation, but can be deleterious to other cellular mechanisms, triggering protein phosphorylation events related with AD pathogenesis. This observation highlights the need to address a large array of cellular responses, particularly when considering the development of new therapeutic strategies. In summary, the results here presented suggest that Zn2+ and Cu2+ might have a neuroprotective effect while Al3+ and Fe3+ appear to be neurotoxic. The work developed throughout this thesis helps clarify the metal-modulated protein phosphorylation events associated with AD and to identify candidates for a future metal-based therapeutic strategy for protein aggregation related diseases.

Os iões metálicos desempenham papéis essenciais no cérebro, e anomalias nos seus níveis podem contribuir para a disfunção neuronal em diferentes doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA). As Placas Senis (PSs) e as Tranças Neurofibrilares (TNFs) são marcadores histológicos da DA, sendo resultantes da deposição extracelular do péptido Aβ1-42 e da acumulação de tau hiperfosforilada, respetivamente. Na DA, a atividade da proteína fosfatase 1 (PP1) e da proteína fosfatase 2A (PP2A) está diminuída contribuindo para a hiperfosforilação da tau e para a agregação do péptido Aβ. Além disso, a atividade das fosfatases diminui após exposição a diferentes metais. As proteínas fosfatases (PFs) estão envolvidas na desfosforilação de diversas proteínas envolvidas em diversos processos biológicos. A atividade das PFs pode ser regulada por várias proteínas interatoras (PIFs), que por sua vez também podem ser reguladas por metais, conferindo às PFs especificidade para um determinado alvo. Estas proteínas interatoras podem ser alvos terapêuticos promissores para modular a atividades das PFs, com efeitos tóxicos reduzidos. No entanto, os efeitos dos metais na fosforilação de proteínas e o seu impacto na agregação de proteínas e na patologia da DA não estão ainda totalmente elucidados. Posto isto, o trabalho apresentado nesta tese tem como objetivo avaliar o efeito dos metais em eventos associados à fosforilação e agregação de proteínas, no fenótipo de DA e identificar potenciais complexos metal-PIFs-PFs que possam ser considerados como futuros alvos terapêuticos para doenças associadas a agregação de proteínas. A agregação de proteínas foi avaliada em células de neuroblastoma SH-SY5Y por citometria de fluxo e microscopia após a exposição aos catiões metálicos Zinco (Zn2+), Cobre (Cu2+), Alumínio (Al3+) e Ferro (Fe3+). Os resultados mostraram um efeito distinto dos metais divalentes e trivalentes na agregação de proteínas. Enquanto os catiões divalentes diminuíram a formação de agregados de proteína, os metais trivalentes não alteraram os níveis de agregação. Adicionalmente, demonstramos que os agregados formados após a exposição a metais são morfologicamente diferentes dos agregados induzidos quando células SH-SY5Y são expostas ao péptido Aβ agregado. Nomeadamente, o péptido Aβ induziu a formação de agregados proteicos maiores, contrastando com os agregados pequenos que foram visualizados após a exposição a metais. Para avaliar o efeito dos metais diretamente na agregação do péptido Aβ, Zn2+, Cu2+, Al3+ and Fe3+ foram co-incubados in situ com Aβ1-42. Observou-se que os catiões divalentes diminuíram a formação de fibrilas e oligómeros amilóides. Em contrapartida, os catiões trivalentes induziram um pequeno aumento na formação de oligómeros Aβ, a forma mais tóxica do péptido. Em seguida, o impacto dos metais a nível molecular foi avaliado. Observou-se que o Al3+ e Fe3+ induzem a fosforilação da Proteína Precursora β-amilóide (PPA), bem como a fosforilação da proteína tau, estando ambas as associadas à Doença de Alzheimer. Em contraste, os catiões divalentes diminuíram a fosforilação da tau, possivelmente através da modulação da atividade do recetor N-metil-D-aspartato (NMDA), prevenindo a ativação de vias excitotóxicas. Ao longo deste trabalho foi demonstrado que o impacto distinto dos metais na atividade/expressão das PFs pode ser responsável pelos estados de fosforilação alterados das proteínas associadas à DA acima descritas. Contudo, dada a ampla variedade de vias de sinalização reguladas pelas PFs, a modulação direta da sua atividade pode provocar consequências moleculares indesejadas. Desta forma, foi realizada uma análise bioinformática para identificar as PIFs que ligam a metais e que estão envolvidas em doenças associadas com a agregação de proteínas, nomeadamente a DA. Com esta abordagem, 27 PIFs que ligam a metais foram identificadas. Através da sua modulação, os complexos metal-PIFs-PFs podem ser futuros alvos terapêuticos para doenças associadas a agregação de proteínas. O efeito do uso de nanopartículas de óxido de zinco (NPs ZnO) como mecanismo de transporte de Zn em células neuronais foi avaliado, tendo sido concluído que as NPs ZnO têm um efeito benéfico na agregação de proteínas, podendo ser prejudiciais noutros mecanismos celulares, despoletando eventos de fosforilação associados com a patogénese da DA. Esta observação evidencia a necessidade de um estudo em larga escala para avaliar as respostas celulares, particularmente no que diz respeito ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Em suma, os resultados aqui apresentados sugerem que o Zn2+ e o Cu2+ podem ter um efeito neuroprotetor enquanto, por outro lado, o Al3+ e o Fe3+ parecem ser neurotóxicos. O trabalho desenvolvido ao longo desta tese ajuda a clarificar os eventos de fosforilação de proteínas modulados por metais e associados à Doença de Alzheimer, bem como identificar candidatos para uma futura estratégia terapêutica baseada em metais para doenças de agregação de proteínas.

Programa Doutoral em Biomedicina