Isolamento e caracterização bioquímica das bactérias do ácido láctico do queijo São Jorge DOP

Dissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar.

O Queijo São Jorge DOP é um queijo tradicional da ilha de São Jorge, um produto emblemático dos lacticínios açorianos que adquiriu fama através das suas características organolépticas únicas, no entanto, poucos tem sido os trabalhos desenvolvidos para o estudo da sua microflora láctica. É bem conhecido que as bactérias lácticas ditas “selvagens”, provenientes de leite cru ou de “culturas de arranque” artesanais, como sejam o soro ou a coalhada guardados do fabrico anterior, estão ligadas às características de tipicidade dos queijos artesanais, não só porque influenciam o processo de acidificação do leite, acelerando a coagulação e a sinérese do soro, mas também porque contribuem directamente para o sabor, corpo e textura do queijo acabado (Awad et al., 2007; Franciosi et al., 2009). O presente trabalho teve como principal objectivo o isolamento e caracterização bioquímica das bactérias do ácido láctico (BAL) do Queijo São Jorge DOP. Obtiveram-se um total de 41 isolados puros pertencentes ao grupo das bactérias do ácido láctico, pertencentes às seguintes espécies: Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus ssp. curvatus, Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Pediococcus pentosaceus e Enterococcus durans. As espécies mais frequentes foram o Lb paracasei ssp. paracasei e o Lactococcus lactis ssp. lactis. A fim de aferir e caracterizar o potencial tecnológico destes isolados foram estudados: as curvas de crescimento; capacidade de crescimento, a diferentes pH, a diferentes concentrações de NaCl e a diferentes temperaturas; produção de CO2 a partir da glicose; a hidrólise da arginina; capacidade de acidificação do leite; a actividade proteolítica; produção de diacetilo; perfil enzimático; actividade antimicrobiana em relação à Listeria monocytogenes e ao Staphylococcus aureus; e o perfil de resistência a 10 antibióticos. Para além de, pela primeira vez, nos Açores, se ter constituído uma colecção de isolados de Bactérias do Ácido Láctico características do Queijo São Jorge, devidamente preservadas e guardadas para estudos posteriores e para o eventual desenvolvimento futuro de uma Cultura de Arranque específica para este Queijo, evitando-se a contaminação com bactérias patogénicas pelo “soro fermento” hoje usado, os estudos realizados permitiram algumas ilações das quais destacamos: Ao estudar a taxa de crescimento dos isolados verificou-se que não há uma correlação entre os valores observados e a espécie. Entre os isolados da mesma espécie também se verificou uma grande variabilidade. Os isolados com uma maior velocidade de acidificação, após as 24 horas de crescimento, foram o Lb. paracasei ssp. paracasei e o Lb. plantarum (0,096 Δph/h), contudo foi o isolado da espécie Lb. plantarum que obteve um pH final mais baixo (3,7). Por outro lado, foi a espécie Streptococcus salivarius ssp. thermophillus que teve uma velocidade de acidificação menor (0,023 Δph/h). Relativamente à capacidade de acidificação do leite o Lb. paracasei ssp. paracasei revelou ser a bactéria com maior capacidade de acidificação tendo sido a que apresentou um pH às 4h mais baixo (6,4), sendo os isolados da estirpe Enterococcus durans e Lc. lactis ssp lactis os que apresentaram uma maior acidificação, com pH de 6,2 e 6,3, respectivamente. Verificou-se que o Lb. plantarum foi o que apresentou uma maior capacidade de inibição tanto da L. monocytogenes como do S. aureus. Este último foi o que se revelou menos sensível, além de que nenhum isolado foi capaz de inibi-lo quando se testou a actividade apenas dos sobrenadantes, sugerindo que o mecanismo de inibição exige o contacto das BAL com o agente patogénico. Avaliou-se ainda até que ponto a actividade antimicrobiana se devia ao abaixamento do pH, tendo-se verificado que efectivamente a actividade decrescia, ou mesmo se perdia completamente, e.g. para o Lb. paracasei ssp. paracasei e para o Lc. lactis ssp. Lactis, sempre que se neutralizou o meio. Os isolados de Lc. lactis ssp. lactis foram os únicos em que o sobrenadante perdeu a actividade após o tratamento térmico, o que constitui um forte indicador de que actividade antimicrobiana se deve a um composto de natureza proteica. As espécies que melhor resistiram ao pH ácido foram Lb. curvatus ssp. curvatus, Lb. rhamnosus, e quase todos os isolados de Lb. paracasei ssp. paracasei, seguindo-se o Lb. plantarum e o Enterococcus durans. As BAL estudadas denotaram alguma capacidade de crescer em ambientes salinos, contudo, alguns dos isolados foram inibidas em concentrações NaCl superiores a 6,5%. O Lb. plantarum foi a que apresentou melhor crescimento nas concentrações de 8% e 12%, seguindo-se o Lb. curvatus ssp. curvatus, alguns isolados da espécie Lb. paracasei ssp. paracasei e o Pediococcus pentosaceus. Verificou-se que nenhum dos isolados produzia CO2 a partir da glucose. Na hidrólise da arginina todos os isolados foram positivos. Algumas das BAL estudadas revelaram capacidade de produção de diacetilo a partir do citrato: Lb. curvatus ssp. curvatus, alguns isolados das espécies Lb. paracasei ssp. paracasei, Lc. lactis ssp. lactis e Enterococcus durans. Relativamente à actividade proteolítica à excepção do Pediococcus pentocaseus, todos os isolados foram positivos, contudo, na espécie Lb. plantarum esta actividade foi fraca. As BAL têm a capacidade para a produção de um grande número de enzimas glicolíticas, lipolíticas e proteolíticas. No entanto nenhuma das espécies isoladas produziu lipases. À excepção do Lb. paracasei ssp. paracasei, em todas as espécies foi identificado a produção de aminopeptidases. Apenas as espécies de Lb. plantarum e Lb. rhamnosus produziram a enzima β-galactosidase. No teste de sensibilidade aos antibióticos verificou-se que a maior parte dos isolados se mostraram resistentes aos antibióticos testados, sendo na totalidade das estirpes resistentes ao cloranfenicol; 97,56% à rifampicina e à lincomicina, 95,12% à norfloxicina e à ampicilina 92,68% à penicilina; 82,93% à clindamicina e 78,05% à gentamicina e ao sulfametoxazole/trimetropina. No entanto, apresentaram maior sensibilidade intermédia à eritromicina (63,41%).

ABSTRACT: The São Jorge PDO cheese is a traditional cheese from the island of São Jorge, a flagship product of Azorean dairy that became famous through its unique organoleptic characteristics, however, little work has been done for the study of its lactic microflora. It is well known that “wild” lactic acid bacteria from raw milk are linked to the typical characteristics of the artisanal cheeses, not only because influence the process of acidification of milk, speeding coagulation and whey syneresis, but also because they directly contribute to the flavor, body and texture of the finished cheese (Awad et al. 2007; Franciosi et al., 2009). This work had as main objective the isolation and biochemical characterization of lactic acid bacteria (LAB) of the São Jorge DOP cheese. We obtained a total of 41 pure isolates belonging to the group of lactic acid bacteria and to the following species: Lactobacillus paracasei ssp paracasei, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus ssp. curvatus, Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Pediococcus pentosaceus and Enterococcus durans. The most frequent species were Lb paracasei ssp. paracasei and Lactococcus lactis ssp. lactis. In order to measure and characterize the technological potential of these isolates the following aspects were studied: growth curves; growth capacity, at different pH, different concentrations of NaCl, and at different temperatures; CO2 production from glucose; hydrolysis of arginine; acidification ability of milk; proteolytic activity; production of diacetyl; enzymatic profile, antimicrobial activity against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus, and resistance profile of the 10 antibiotics. In addition of a collection of isolates of lactic acid bacteria specific of São Jorge cheese available for the first time in the Azores, properly preserved and stored for further studies and for future development of a specific starter culture for this cheese, avoiding contamination with pathogenic bacteria by the "whey starter" used today, this studies have allowed some additional knowledge about these lactic acid isolates: By studying the rate of growth of the isolates revealed no correlation between the observations and each one the species. Among the isolates of the same species was also found a large variability. Isolates with a higher rate of acidification after 24 hours of growth, were Lb. paracasei ssp paracasei and the Lb. plantarum (Δph 0.096/h), however the species who obtained a lower final pH (3.7) was Lb. plantarum. On the other hand Streptococcus salivarius ssp. thermophillus had a lower rate of acidification (0.023 Δph/h). For the acidification of the milk Lb. paracasei ssp. paracasei proved to be the most capable with a lower pH at 4 hours (6.4). Enterococcus durans and Lc. lactis ssp. lactis who had a greater acidification potential attaining a pH 6.2 and 6.3, respectively. It was found that the Lb. plantarum showed the greater capacity to inhibit both the L. monocytogenes and S. aureus. This last one proved to be less sensitive, and no one isolate was able to inhibit it when it when tested the activity of the supernatant, suggesting that the mechanism of inhibition of BAL requires contact with the pathogen. We also evaluated the extent to which antimicrobial activity was due to the lowering of pH. It was found that the activity actually decreased, or was even completely lost, eg for Lb. paracasei ssp. paracasei and for Lc. lactis ssp. lactis, when the medium was neutralized. The supernatant of isolates the Lc. lactis ssp. lactis were the only one in loose its activity after heat treatment, which is strong indicator that antimicrobial activity is due to a compound proteic in nature. The species that best withstood the acid pH were Lb. curvatus ssp. curvatus, Lb. rhamnosus, and almost all isolates of Lb. paracasei ssp paracasei, followed by Lb. plantarum and Enterococcus durans. The BAL studied denoted some ability to grow in saline environments, however, some of the isolates were inhibited at concentrations above 6.5% NaCl. The Lb. plantarum showed the best growth at concentrations of 8% and 12%, followed by Lb. curvatus ssp curvatus, some isolates of the Lb. paracasei ssp. paracasei and Pediococcus pentosaceus. It was found that none of the isolates produced CO2 from glucose. Hydrolysis of arginine in all isolates were positive. Some of the BAL study revealed a production capacity of diacetyl from citrate: Lb. curvatus ssp. curvatus, some isolates of Lb. paracasei ssp. paracasei, Lc. lactis ssp. lactis and Enterococcus durans. For the proteolytic activity all isolates were positive, other than Pediococcus, pentocaseus however Lb. plantarum isolates had a weak activity. BAL have the ability to produce a large number of glycolytic enzymes, lipolytic and proteolytic enzymes. However none of the isolated strains produced lipases. With the exception of Lb. paracasei ssp. paracasei, in all other species was identified the production of aminopeptidases. Only Lb. plantarum and Lb. rhamnosus produced the enzyme β-galactosidase. The antibiotic sensitivity test showed that the majority of the isolates were resistant to the antibiotics tested. All the strains where resistant to chloramphenicol; 97.56% to rifampicin, and lincomycin; 95.12% to ampicillin and norfloxicina; 92.68% penicillin; 82.93% to clindamycin; and 78.05% to gentamicin and sulfamethoxazole/trimethoprim. However, most of them had a intermediate susceptibility to erythromycin (63.41%).

Governo dos Açores; SRCTE; DRCTC; PROEMPREGO