Estudio funcional de la autofagia por estrés específico en el cloroplasto de la microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii

La autofagia es un proceso catabólico ampliamente conservado en eucariotas por el cual se degradan componentes celulares incluyendo proteínas, ribosomas u orgánulos completos para mantener la homeostasis celular. La síntesis de ácidos grasos se localiza en el estroma del cloroplasto de plantas y algas. Los ácidos grasos sintetizados de novo por la enzima ácido graso sintasa (FAS) se utilizan como precursores de los lípidos esenciales para la estructura del cloroplasto y su función. El objetivo principal de esta tesis es investigar la conexión entre el proceso de autofagia y la inhibición de la síntesis de ácidos grasos en el cloroplasto de la microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. Los resultados de esta tesis demuestran que la inhibición de la enzima FAS mediante la droga cerulenina, un inhibidor específico de esta enzima, activa el proceso de autofagia. El tratamiento con esta droga disminuye la abundancia del lípido monogalactosil diacilglicerol (MGDG), el lípido mayoritario de las membranas plastídicas. Además, este tratamiento disminuye la eficiencia fotosintética y aumenta los niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS). Igualmente, mediante microscopía electrónica de transmisión se observó que las membranas tilacoidales presentan un alto grado de empaquetamiento y un mayor número de membranas por apilamiento en células tratadas con cerulenina. Por otro lado, el análisis transcriptómico realizado en estas células mostró la inducción de genes de respuesta a estrés en el cloroplasto y la acumulación de transcritos relacionados con la detoxificación de ROS. Así, nuestros resultados indican que existe una relación entre el metabolismo de lípidos, la respuesta a estrés en el cloroplasto y el proceso de autofagia en Chlamydomonas reinhardtii. Para profundizar en el estudio de la inhibición de la enzima FAS y su conexión con la autofagia en este organismo modelo, se generó un mutante deficiente de autofagia mediante el sistema de edición genético CRISPR/Cas9. El mutante atg8 presenta una inserción en el gen ATG8 que codifica una proteína clave en el mecanismo central de la autofagia. Nuestros resultados indican que esta estirpe mutante presenta un retraso en su crecimiento al entrar en fase estacionaria e hipersensibilidad al tratamiento con cerulenina en concentraciones sub-letales de esta droga. Además, la inhibición de la enzima FAS en el mutante atg8 provoca un daño estructural en el cloroplasto, inhibe la fotosíntesis, aumenta los niveles de ROS y activa la expresión de genes relacionados con la autofagia, el proteasoma y el estrés en el cloroplasto. Para finalizar con la caracterización de esta estirpe se realizó un estudio proteómico cuantitativo. Nuestros resultados mostraron un aumento en la abundancia de proteínas relacionadas con la respuesta a estrés en el cloroplasto, una desregulación en las proteínas fotosintéticas y un desajuste en el metabolismo de lípidos y aminoácidos, indicando que el mutante atg8 tratado con cerulenina presenta una alteración en el flujo del carbono.