Función del sistema redox NTRC-2-Cys peroxirredoxinas en fases tempranas del desarrollo vegetal en Arabidopsis thaliana

Las plantas son organismos sésiles que necesitan adaptar su metabolismo a condiciones ambientales cambiantes e impredecibles en la naturaleza. En cloroplastos de las hojas adultas, la regulación redox basada en el intercambio disulfuro-ditiol desempeña un papel clave en la rápida aclimatación del rendimiento fotosintético a los cambios ambientales. Los cloroplastos albergan dos sistemas de regulación redox. El sistema clásico depende de la ferredoxina (Fd) reducida fotosintéticamente, que transfiere equivalentes reductores a las tiorredoxinas (TRXs) a través de la actividad de una TRX reductasa dependiente de Fd (FTR), por lo que el sistema Fd-FTR-TRX vincula la regulación redox del cloroplasto a la luz. Además, estos orgánulos están equipados con una tiorredoxina reductasa dependiente de NADPH, denominada NTRC, que permite el uso de NADPH para la regulación redox. NTRC es un reductor eficiente de las 2-Cys peroxirredoxinas (PRXs), peroxidasas tiol-dependientes que controlan el estado redox de las TRXs del cloroplasto, ajustando así el rendimiento fotosintético del orgánulo en respuesta a los cambios en la intensidad de la luz y a la oscuridad. En consonancia con esta importante función, el mutante ntrc de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), que carece de NTRC, muestra un rendimiento fotosintético gravemente alterado e inhibición del crecimiento, mientras que el mutante 2cpab, que carece de las dos 2-Cys PRXs, A y B, presentes en los cloroplastos de Arabidopsis, muestra inhibición del crecimiento y sensibilidad al estrés lumínico elevado. Sorprendentemente, el fenotipo más grave del mutante 2cpab se observó en fases tempranas del desarrollo de la planta, ya que mostró defectos en la producción de semillas y en el desarrollo de cotiledones en la fase post-germinativa. Estos defectos de desarrollo sugieren funciones relevantes de los sistemas redox plastidiales en etapas tempranas del desarrollo de la planta, que hasta ahora no se conocen bien. Por lo tanto, para abordar la función de los sistemas redox plastidiales en el desarrollo temprano de la planta, en esta tesis doctoral nos planteamos el objetivo general de analizar las funciones de NTRC y 2-Cys PRXs en el desarrollo de la semilla y el crecimiento temprano de la plántula, mediante una combinación de enfoques genéticos, bioquímicos y fisiológicos. En primer lugar, se generaron plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaban, bajo el control de sus respectivos promotores, NTRC, 2-Cys PRX A o 2-Cys PRX B marcadas con GFP, lo que permitió establecer el patrón de expresión de estos genes durante el desarrollo de las semillas mediante microscopía confocal. NTRC y 2-Cys PRXs A y B se detectaron en embriones en desarrollo en el estadio de Corazón y Globular, respectivamente, aumentando su contenido en estadios posteriores, coincidiendo con la diferenciación de los cloroplastos en los embriones. Asimismo, la mayoría de los embriones aberrantes del mutante 2cpab detuvieron su desarrollo en los estadios Corazón y Torpedo, lo que indica la función esencial de las 2-Cys PRXs en la embriogénesis. Esta función es independiente de NTRC ya que ni la sobreexpresión ni la falta de NTRC tienen efecto alguno en el desarrollo embrionario, en claro contraste con la función de estos sistemas reguladores redox en los cloroplastos de plantas adultas. Además, analizamos la función de las 2-Cys PRXs durante la etapa post-germinativa. El crecimiento de plántulas 2cpab en presencia de azúcares metabolizables, como la sacarosa, incrementa la presencia de plántulas con cotiledones albinos y asimétricos/variegados, que contienen plastidios con alteraciones ultraestructurales. Este fenotipo fue similar al mostrado por la sobreexpresión de NTRC en plantas con niveles WT de 2-Cys PRXs, mientras que la falta de NTRC no tuvo ningún efecto, sugiriendo así que la diferenciación alterada del cloroplasto se produce cuando el orgánulo sufre una sobre-reducción. Curiosamente, tanto las plántulas albinas como las asimétricas/variegadas generaron hojas verdaderas verdes, lo que indica que las 2-Cys PRXs tienen un papel esencial específicamente en la diferenciación de cloroplastos a partir de proplastidios embrionarios, y no en los originados a partir de células meristemáticas. En consonancia con estos resultados, las plántulas del mutante 2cpab mostraron un retraso en la transición de la escotomorfogénesis (etiolación) a la fotomorfogénesis (des-etiolación), lo que confirma la contribución de las 2-Cys PRXs a la biogénesis de los cloroplastos. En las plántulas des-etioladas, las chaperonas del cloroplasto cpHSP70 y DUF179-1 (interactor de CLPC1) se identificaron como interactores de las 2-Cys PRXs, lo que sugiere que la función de estas enzimas en la biogénesis del cloroplasto está relacionada con el importe, procesamiento y plegamiento de proteínas en el orgánulo. Dado que 2-Cys PRXs comparte estas dianas con GUN1, una proteína que media la señalización retrógrada cloroplasto-núcleo, investigamos la relación funcional de 2-Cys PRXs y GUN1 mediante la generación del mutante triple 2cpab-gun1 (knock-out para 2-Cys PRXs y GUN1). Las deficiencias combinadas de 2-Cys PRXs y GUN1 causaron defectos aditivos en el desarrollo temprano y adulto de la planta, sugiriendo la acción concertada de ambas proteínas en la proteostasis del cloroplasto.

Plants, as sessile organisms, adapt their metabolism to continuously changing and unpredictable environmental conditions in nature. In chloroplasts of adult leaves, redox regulation based on disulphide-dithiol exchange plays a key role in the rapid acclimation of photosynthetic performance to environmental changes. Chloroplasts harbor two redox regulatory systems. The classical system relies on photosynthetically reduced ferredoxin (Fd), which transfers reducing equivalents to thioredoxins (TRXs) via the activity of a Fd-dependent TRX reductase (FTR), thus, the Fd-FTR-TRX system links chloroplast redox regulation to light. In addition, these organelles are equipped with an NADPH-dependent thioredoxin reductase, termed NTRC, which allows the use of NADPH for redox regulation. NTRC is an efficient reductant of the thiol-dependent peroxidase 2-Cys peroxiredoxins (PRXs), and it was proposed that both, NTRC and 2-Cys PRXs, form a system that controls the redox state of chloroplast TRXs, hence fine-tuning the photosynthetic performance of the organelle in response to changes in light intensity and darkness. In line with this important function, the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) ntrc mutant, which lacks NTRC, shows severely altered photosynthetic performance and inhibition of growth, whereas the 2cpab mutant, which lacks the two 2-Cys PRXs, A and B, present in Arabidopsis chloroplasts, show growth inhibition and sensitivity to high light stress. Surprisingly, the most severe phenotype of the 2cpab mutant was observed at earlier stages of plant development since it showed defective seed production and cotyledon development at the post-germinative stage. These developmental defects suggested relevant functions of plastidial redox systems at early plant developmental stages, which are so far poorly understood. Thus, to address the function of plastidial redox systems in early plant development, in this doctoral thesis we set out the general objective of analyzing the roles of NTRC and 2-Cys PRXs in seed development and early seedling growth, which was addressed by a combination of genetic, biochemical, and physiological approaches. First, transgenic Arabidopsis plants expressing GFP-tagged versions of NTRC, 2-Cys PRX A and 2-Cys PRX B were generated under the control of their respective endogenous gene promoters, which allowed to establish the pattern of expression of these genes during seed development by confocal microscopy. NTRC and 2-Cys PRXs A and B were detected in developing embryos at the Heart and Globular stages, respectively, coinciding with embryonic chloroplast differentiation. The 2cpab mutant showed defective embryos, which were arrested at Heart and Torpedo stages, indicating the essential function of 2-Cys PRXs in embryogenesis. This function is independent of NTRC since neither the over-expression nor the lack of NTRC have any effect on embryo development, in clear contrast with the function of these redox regulatory systems in adult plants. Furthermore, we analyzed the function of 2-Cys PRXs during the post-germinative stage. The growth of 2cpab seedlings in the presence of metabolizable sugars, such as sucrose, led to the appearance of seedlings with albino and variegated cotyledons, which contain defective plastids. These phenotypes were mimicked by overexpression of NTRC in WT plants, while the lack of NTRC had no effect, thus suggesting that altered chloroplast differentiation occurs when the organelle undergoes over-reduction. Interestingly, albino and variegated seedlings generated green true leaves, indicating that 2-Cys PRXs have an essential role specifically in chloroplast differentiation from embryo proplastids, but not in those originating from meristematic cells. Consistent with these results, seedlings of the 2cpab mutant showed delayed transition from skotomorphogenesis (etiolation) to photomorphogenesis (de-etiolation), confirming the contribution of 2-Cys PRXs to chloroplast biogenesis. In de-etiolated seedlings, chloroplast chaperone cpHSP70 and DUF179-1 (CLPC1 interactor) were identified as 2-Cys PRX interacting partners, strongly suggesting that the function of these enzymes in chloroplast biogenesis is related with protein import, processing and folding in the organelle. Given that 2-Cys PRXs shares these interactors with GUN1, a protein that mediates the chloroplast-to-nucleus retrograde signaling, we investigated the functional relationship of 2-Cys PRXs and GUN1 by generating the triple mutant 2cpab-gun1 (knock-out for 2-Cys PRXs and GUN1). The combined deficiencies of 2-Cys PRXs and GUN1 caused additive defects in early and adult plant development, suggesting the concerted action of both proteins in chloroplast proteostasis.