Desarrollo de una sonda de ADN de origen plasmídico para la identificación y detección de neisseria gonorrhoeae

Neisseria gonorrhoeae, es el agente causal de la gonococia, enfermedad de transmisión sexual reconocida como una de las causas principales de morbilidad en muchas zonas del mundo (Donegan, 1985). La gonococia es a menudo recurrente y ocasionalmente produce complicaciones, como la enfermedad inflamatoria pélvica –causa de embarazos ectópicos e infertilidad--, la infección gonocócica diseminada y la epididimitis, entre otras. Ya que el diagnóstico de la gonococia en una persona puede tener importantes consecuencias personales, sociales y médico-legales (Whittington et al., 1988), es muy importante la correcta identificación de Neisseria gonorrhoeae. Para este motivo se han desarrollado diversas pruebas para la confirmación de un diagnóstico clínico (Dillon et al., 1988). En un paciente con alto riesgo que acude a un centro de diagnóstico de enfermedades de transmisión sexual, es posible hacer un diagnóstico presuntivo basado en la observación de diplococos Gram-, extra e intracelulares (dentro de leucocitos pólimorfonucleares), en una tinción de Gram. Este método es válido en varones sintomáticos, para los que la tinción de Gram presenta una sensibilidad del 96 al 98% (Morse & Knapp 1987). Sin embargo, en varones asintomáticos y en infecciones cervicales o extragenitales, la sensibilidad desciende al 40-60% (Handsfield et al., 1974, Oxtoby et al., 1982). Otra forma de diagnóstico presuntivo es la observación de crecimiento de diplococos Gram- Oxidasa+ en medio selectivo para gonococo. La utilidad de este método es limitada, ya que cuando se aplica a una muestra faríngea existe el riesgo de confusión con Neisseria meningitidis, que se puede encontrar en orofaringe de forma asintomática (Greenfield et al., 1971) y es capaz de crecer en medio selectivo para gonococo. También cabe la confusión con otras neisserias no patógenas, flora habitual de orofaringe, que ocasionalmente crecen en medio selectivo para gonococo (Knapp et al., 1984, Dossett et al., 1985, Knapp 1988). Además del diagnóstico presuntivo, se han desarrollado numerosas pruebas para la realización de un diagnóstico definitivo de laboratorio: desde las pruebas bioquímicas tradicionales, que necesitan una incubación de 24-48 horas antes de la lectura del resultado, hasta pruebas de identificación rápidas, que proporcionan los resultados en menos de 4 horas. Las pruebas tradicionales tienen la ventaja de que caracterizan más detalladamente el microorganismo aislado, pero su uso puede demorar la identificación, con lo que se retrasa la instauración de un tratamiento antimicrobiano y aumenta el riesgo de complicaciones o de transmisión a la pareja sexual. En contraste, algunas pruebas rápidas no siempre nos aseguran la identificación porque la información sobre el microorganismo es muy limitada. La mayoría de estas pruebas se han diseñado específicamente para confirmar aislamientos Gram- Oxidasa+, que han sido identificados de forma presuntiva sobre el medio selectivo como Neisseria gonorrhoeae. Las desventajas de necesitar el cultivo del microorganismo son, entre otras: la pérdida de viabilidad del gonococo bajo condiciones subóptimas de transporte y crecimiento, la pérdida de sensibilidad del cultivo cuando se han instaurado la terapia antimicrobiana, y la existencia de estirpes sensibles a Vancomicina, que no crecen en los medios que se emplean habitualmente, u otras estirpes con características de crecimiento difíciles. Es indiscutible que un método que obviara el cultivo supondría una gran ventaja, sobre todo para el diagnóstico en consultorios que no disponen de la infraestructura necesaria para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae y que actualmente envían las muestras a laboratorios de referencia con gran riesgo de pérdida de viabilidad durante el transporte. Entre los métodos de confirmación de Neisseria gonorrhoeae a partir de cultivo, los hay que se basan en la producción de ácidos a partir de azúcares, en la utilización de un sustrato cromogénico por una determinada enzima, en la detección de antígenos, y en la homología del ADN. Para la determinación de la producción de ácidos a partir de azúcares se utilizan los carbohidratos glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa. Hay numerosos productos comerciales que sirven para realizar esta determinación, entre ellos Minitek (BBL Microbiology Systems), Quadferm+ (Analyticals Products), RIM-N (American Micro Scan), Neisseria-Stat (Richardson Scientific) y Neisseria-Kwik (Micro-biologics). Puesto que todos ellos se realizan a partir de un cultivo puro, una cepa no puede ser identificada hasta 24 horas después de su aislamiento. Aunque el uso de estas pruebas está muy extendido, presentan algunos problemas en la identificación de Neisseria gonorrhoeae: 1) En algunas cepas la producción de ácidos es difícil de interpretar cuando se utilizan los sistemas Minitek, Neisseria-Stat y Neisseria-Kwik (Welch & Cartwright 1988). 2) Otras cepas, incluyendo las que pertenecen al auxotipo AHU, producen ácido a partir de glucosa de una forma débil y pueden ser interpretadas como glucosa-negativo (Morello et al., 1976). Por otro lado, algunas cepas de Neisseria cinerea consideradas tradicionalmente como glucosa-negativo (Vedros 1984) pueden dar una reacción positiva con la glucosa y ello conduce a un diagnóstico erróneo de gonococia (Knapp et al., 1984; Boyce et al., 1985; Dossett et al., 1985). Las pruebas enzimáticas con sustrato cromogénico también se realizan a partir de microorganismos aislados en medio selectivo. Diplococos Gram- Oxidasa+ se inoculan en sustrato cromogénico y un cambio en el color indica la producción de Hidroxiprolilaminopeptidasa por Neisseria gonorrhoeae. Los sistemas comercializados son Gonochek II (E I du Pont de Nemours & Co.) e Identicult-Neisseria IDN (Scott Laboratories), que también conducen a veces a determinaciones erróneas, pues algunas cepas de Neisseria sublava, Neisseria cinerea y Klebsiella denitrificans pueden crecer en medio selectivo para Neisseria gonorrhoeae y producir Hidroxiprolilaminopeptidasa (Dossett et al., 1985, Janda et al., 1985, Dillon et al., 1988). Otra serie de métodos que se usan con frecuencia en la actualidad son los serológicos, que incluyen pruebas para la detección de antígeno gonocócico directamente en la muestra clínica (Gonozyme, Abott Laboratories) y coaglutinación y anticuerpos fluorescentes (AF) para la confirmación del cultivo. El Gonozyme se desarrolló para la detección de antígenos gonocócicos en exudados cervicales y uretrales. La prueba es específica y sensible en muestras uretrales, pero es menos sensible que el cultivo de cérvix en mujeres (Schachter et., 1984; Stamm et al., 1984). Presenta además reacciones cruzadas con Neisseria cinerea y Neisseria lactamica, y requiere, por tanto, una prueba de confirmación, no dejando de ser un diagnóstico presuntivo (Knapp 1988). La coaglutinación y los test de AF utilizan anticuerpos monoclonales para detectar Neisseria gonorrhoeae. Ya que los ensayos se pueden realizar con colonias de la placa de aislamiento primario y no requieren un cultivo puro, la identificación se puede conseguir 24 horas antes que con las pruebas rápidas de carbohidrato o de enzima sustrato. GonoGen (New Horizons Diagnostics), Phadebact Monoclonal GC OMNI (Pharmacia) y Meritec GC (Meridian Laboratories) son pruebas de coaglutinación para la identificación de Neisseria gonorrhoeae, mientras que SYVA Microtak Neisseria gonorrhoeae Culture Confirmation Test (SYVA) es un reactivo comercial de anticuerpos monoclonales fluorescentes. En general, el diagnóstico con anticuerpos monoclonales en Neisseria gonorrhoeae es sensible y específico (Lawton & Battaglioli 1983, Carlson et al., 1987). A pesar de ello, se han documentado problemas con cada uno de estos reactivos (Minshew et al., 1985; Laughn et al., 1987; Dillon et al., 1988; Wech & Cartwright 1988; Walton 1989; Boehmet et al., 1990). Con el desarrollo de nuevos métodos para el aislamiento y purificación de los ácidos nucleícos, se ha hecho posible el uso de técnicas basadas en la utilización de sondas, tanto de ADN como de ARN, para la detección e identificación de microorganismos patógenos en muestras clínicas. H. zur Hausen y H. Schulte-Holthausen emplearon el término sonda por primera vez en 1970 cuando estudiaban la presencia del virus Epstein-Barr en células tumorales. Detectaron con éxito la presencia de ADN viral en células en las cuales los virus no podían propagarse, estableciendo la sensibilidad de la hibridación de ácidos nucleícos como herramienta diagnóstica. En estos primeros estudios se usaban sondas de ácidos nucleícos que se habían marcado mientras el organismo estaba creciendo o replicándose, es decir, in vivo. En la actualidad, el término de sonda se aplica a secuencias de nucleótidos específicas que, o bien se han obtenido a través de manipulaciones tales como digestión con enzimas y clonaje, seguida por marcaje in vitro, o bien mediante el uso de sintetizadores de ADN. La hibridación con sondas de ácidos nucleícos tiene un valor intrínseco ya que éstas detectan secuencias de ácidos nucleícos específicas y que pueden ser únicas del organismo que se desea detectar. Los otros métodos de detección o identificación se basan en la detección de fenotipos, como reacciones químicas o inmunológicas, que representan el genotipo del organismo. Lo más destacado de esta técnica es pues, que detecta las secuencias genómicas y no una evidencia indirecta de las mismas. Otras ventajas de la hibridación son: a) Reducción de los falsos resultados debidos a cambios fenotípicos del patógeno, b) Aumento del rango de muestras y de patógenos que se pueden procesar, y c) Debido a la estabilidad del ADN, las muestras se pueden transportar sin importar que el patógeno pierda viabilidad y pueden almacenarse durante mucho tiempo. La homología del ADN ya ha sido aplicada en la identificación de bacterias (e.g. Salmonella, Legionella, Mycobacterium), virus (e.g. Rotavirus, Herpes simplex, Citomegalovirus) y parásitos (e.g. Leishmania, Plasmodium falciparum, Pneumocystis) (ver revisiones de Zwadyk & Cooksey 1987 y Tenover 1988). Para Neisseria gonorrhoeae se han comercializado dos sondas, una para la identificación a partir de cultivo (Orthoprobe, Ortho Diagnostics) y otra para la detección en muestras clínicas (Gen Probe PACE, Gen Probe). En Neisseria gonorrhoeae el plásmido críptico de 4,2 Kilobases (Kb) es un excelente marcador, dado que lo poseen el 96% de las cepas (Roberts et al., 1979), y aquellas que no lo llevan suelen tener integrado una parte del mismo en el cromosoma (Biswas et al., 1986). Además, es un plásmido multicopia y existen 30 copias repetidas en cada bacteria (Mayer et al., 1974), hecho que facilita su detección. Este plásmido ha sido utilizado íntegro como sonda marcado con radiactividad (Totten et al., 1983; Perine et al., 1985) y los resultados fueron esperanzadores, aunque no del todo satisfactorios por la aparición de falsos positivos. El objetivo de nuestro trabajo ha sido obtener una sonda a partir del plásmido de 4,2 Kb, de tamaño más reducido, marcada de forma no isotópica, que mejore los resultados obtenidos con el plásmido entero y que permita realizar el diagnóstico de infección gonocócica en menos tiempo y con mayor seguridad que los métodos existentes en la actualidad. Para ello, hemos desarrollado los siguientes puntos: 1.- Aislamiento del plásmido de 4,2 Kilobases de la cepa de Neisseria gonorrhoeae 34/85 y caracterización del mismo. 2.- Obtención de una genoteca a partir del plásmido de 4,2 Kilobases, clonándolo en el vector apropiado y transformando la cepa de Escherichia coli JM101. 3.- Caracterización de los clones y elección del ADN que se iba a utilizar como sonda. 4. Marcaje de la sonda con un sistema no radiactivo. 5. Utilización de la sonda para: a) Hibridación con ADN y cultivos puros de Neisseria gonorrhoeae a distintas concentraciones. b) Hibridación con cultivos puros de otras especies relacionadas filogenética o ecológicamente con Neisseria gonorrhoeae. c) Hibridación con muestras obtenidas de pacientes que acuden al Centro de Enfermedades de Transmisión Sexual de la Facultad de Medicina de Sevilla, y comparación de los resultados con los obtenidos por los procedimientos actuales de diagnóstico de la enfermedad.