Efectos de la aplicación de secuencias de ARN de cadena doble (ARNcd) en el silenciamiento del virus del mosaico del pepino (CMV)

Ilustraciones, gráficas

spa:El silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) es un mecanismo de defensa vegetal conservado evolutivamente contra los virus. Este trabajo tuvo como objetivos probar una construcción de dsDNA (77 pb) como plantilla para la producción in vitro de ARN de horquilla pequeña artificial (shRNA) derivado de virus, además de evaluar tanto estos como RNAs de doble cadena derivados de virus (dsRNA), también producidos in vitro, su potencial para desencadenar el mecanismo de ARNi en plantas de Nicotiana benthamiana contra CMV después de su infiltración foliar. Este enfoque permitió la producción de cantidades significativas de shRNA (60-mers) y de dsRNA (492-508-mers) de forma rápida y sencilla. El silenciamiento de los genes de CMV provocado por shRNA se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ensayos basados en inmunología y PCR en tiempo real (qPCR), mientras que el silenciamiento de los genes provocado por los dsRNA fue confirmado preliminarmente por PCR, Dot-blot y RT-qPCR. Los niveles más altos de silenciamiento génico por la mezcla de shRNAs se registraron para los ARNm que codifican la proteína de replicación (ORF1a), el supresor viral del silenciamiento de ARN (ORF2b) y la proteína de la cápside (ORF3b) con 98, 94 y 70 % del silenciamiento total de la transcripción, respectivamente, al igual que para la mezcla de dsRNAs cuyos niveles de silenciamiento fueron de 78 %, 65 % y 72 %, respectivamente, para los genes ORF1, ORF2a y ORF3b. El protocolo proporciona una alternativa a la producción de shRNA significativos y la aplicación tanto de estos como de dsRNAs que pueden desencadenar eficazmente el mecanismo de RNAi contra CMV.

eng:Post-transcriptional gene silencing (PTGS) is an evolutionarily conserved plant defense mechanism against viruses. This paper aimed to evaluate a dsDNA construct (77 bp) as a template for in vitro production of virus-derived artificial small hairpin RNAs (shRNAs), to evaluating these and virus-derived double-stranded RNAs (dsRNA), also produced in vitro, their potential to trigger the RNAi mechanism in Nicotiana benthamiana plants against CMV after their foliar infiltration. This approach allowed the production of significant amounts of shRNAs (60-mers) and dsRNA (492-508-mers) quickly and easily. ShRNA-induced silencing of CMV genes was confirmed by polymerase chain reaction (PCR), Immunological-based assays, and Real-Time PCR (qPCR) while dsRNA-induced gene silencing was confirmed preliminarily by PCR, Dot-blot and qPCR. The highest levels of gene silencing by the mixture of shRNAs were recorded for mRNAs coding for replication protein (ORF1a), the viral suppressor of RNA silencing (ORF2b), and the capsid protein (ORF3b) with 98, 94, and 70 % of total transcript silencing, respectively. Similar results were obtained for the mixture of dsRNAs whose silencing levels were 78%, 65% and 72%, respectively for the genes ORF1, ORF2a and ORF3b. The protocol provides an alternative to producing significant shRNAs that can effectively trigger the RNAi mechanism against CMV as well as dsRNAs.

AGRADECIMIENTOS/vi DEDICATORIA /vii LISTA DE FIGURAS/..viii LISTA DE TABLAS /.ix LISTA DE ANEXOS/.x Nota al lector./.xi Pregunta de investigación/ Objetivos/ Objetivo general/ Objetivos específicos:/ Descripción del trabajo: / CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN/Bibliografía / CAPÍTULO II: PRIMER ARTÍCULO / Evaluación de métodos para la inoculación y diagnóstico del virus del mosaico del pepino (CMV)*/ MÉTODO/ Inoculación del CMV / Detección del CMV en plantas inoculadas/ Sintomatología/ Serología / Moleculares/RT-PCR / RESULTADOS/ Métodos de detección del CMV/ Detección viral por sintomatología/ Detección viral mediante ImmunoStrip®/ Detección por RT-PCR/ CONCLUSIONES/ REFERENCIAS/ CAPÍTULO III: SEGUNDO ARTÍCULO / Foliar Infiltration of Virus-Derived Small Hairpin RNAs Triggers the RNAi Mechanism against the Cucumber Mosaic Virus / 1. Introduction / 2. Results / 2.1. Synthesis, quality, and yield of shRNAs/ v 2.2. Primer efficiency and specificity/ 2.3. Effect of virus-derived artificial shRNAs on CMV infection/ 2.4. Immunological-based assays for specific detection of CMV/ 2.5. PCR and qPCR / 3. Discussion / 4. Materials and Methods/ 4.1. Design and synthesis of shRNAs/ 4.2. Plants, virus maintenance and shRNAs infiltration / 4.3. Protein extraction and quantitation/ 4.4. Immunological-based assays for specific detection of CMV/ 4.5. RNA isolation and cDNA synthesis / 4.6. PCR, quantitative real-time PCR (qPCR) and primer efficiency test / 4.7. Statistical analysis/ 5. Conclusions/ References/ CAPÍTULO IV: TERCER ARTÍCULO / Aplicación tópica de dsRNAs, como alternativa al silenciamiento génico del virus del mosaico del pepino / RESUMEN / Abstract/ Introducción/ Materiales y métodos/ Extracción de RNA y síntesis de cDNA/ Diseño y síntesis de moléculas de silenciamiento de dsRNAs / dsRNAs/ Dot-blot / RT-qPCR. / Análisis estadísticos/ Resultados y discusión / Síntesis, calidad y rendimiento de dsRNAs/ Silenciamiento de CMV vía dsRNAs / Prueba serológica para detección de CMV/ Eficiencia de cebadores y especificidad/ RT-qPCR / Bibliografía/ CAPÍTULO V: DISCUSIÓN GENERAL / Bibliografía.

Doctorado

Doctor(a) en Ciencias Agrarias

Evaluación y validación del silenciamiento génico como estrategia para el manejo de fitopatógenos